環氧合酶-2、5-脂氧合酶及代謝產物對結腸腺瘤-腺癌發生發展的影響

方興國，李波濤，劉模榮，王 紅，劉華慶，文國榮

(1.遵義醫科大學附屬醫院 消化內科, 貴州 遵義 563099； 2.遵義醫科大學附屬醫院 病理科， 貴州 遵義 563099)

結腸癌在消化道惡性腫瘤中發病率僅次于胃癌，位居第二，近年來其發病率呈不斷上升趨勢，尤其是中青年更為明顯。通過外科手術、放療、化療等綜合治療取得了一些進步，但總體5年生存率仍低于50%。為此，早期診斷和有效治療成為臨床醫學面臨的挑戰。研究證實超過90%以上的結直腸癌是由腺瘤性息肉惡變而來，從正常的結腸粘膜→息肉→腺癌的系列演變過程中有多種腫瘤因子的參與。環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)表達升高及前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)、白三烯B4(LTB4)生成的增多均參與多種腫瘤的發生、發展，使用環氧合酶-2、5-脂氧合酶抑制劑，可使環氧合酶-2、5-脂氧合酶及相應的下游代謝產物減少，起到抑制腫瘤的作用[1-3]。但它們共同在結腸腺瘤-腺癌演變中的作用了解甚少。本研究擬檢測人的正常結腸粘膜、結腸增生性息肉、結腸腺瘤及腺癌組織中COX-2mRNA、5-LOX mRNA和蛋白質的表達情況，并通過二甲基肼(DMH)建立大鼠結腸腺瘤-腺癌模型，觀察COX-2抑制劑塞來昔布(Celecoxib)、5-LOX抑制劑齊留通(Zileuton)對結腸腺瘤、腺癌發生發展的影響，以及相應結腸組織中的COX-2 mRNA、5-LOX mRNA表達和下游產物PGE2和LTB4濃度的變化，以研究COX-2、5-LOX對結腸腺瘤、腺癌發生發展的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2016年10月至2017年10月在遵義醫科大學附屬醫院消化內科行腸鏡檢查并經病理確診的結腸標本(直徑≥1cm)71例：增生性息肉25例，男12例，女13例，平均為(48±3)歲；腺瘤性息肉31例，男16例，女15例，平均為(46±2)歲；結腸腺癌15例，男7例，女8例，平均為(58±5)歲；正常結腸黏膜組織15例，男8例，女7例，平均為(50±2)歲。所選病例均平時身體健康，主要因出現消化道癥狀就診行腸鏡檢查首次確診的患者。SD大鼠(清潔級，雄性)55只，購于陸軍軍醫大學實驗動物中心(SCXK(渝)2012-0005)，體重180～220g。

1.2 實驗試劑 二甲基肼(Sigma公司)；塞來昔布、齊留通(美侖生物技術有限公司);小鼠抗人β-actin抗體(Santa Cruz公司);驢抗山羊IgG(H+L)(碧云天生物科技研究所)；GTVisionTMⅢ抗鼠兔(基因科技上海有限公司)；山羊抗人5-LOX多克隆抗體和山羊抗人COX-2多克隆抗體(Santa Cruz公司)；山羊IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司)；RT-qPCR轉錄試劑盒及相關引物(寶生物TaKaRa公司)；PGE2、LTB4檢測的ELISA試劑盒(碧云天生物科技研究所)。

1.3 標本處理

1.3.1 結腸息肉及結腸癌 將腸鏡下摘除的息肉、外科手術切除癌組織塊及活檢的正常結腸黏膜剪成大小約2 mm×2 mm×3 mm小塊，等滲鹽水反復沖洗，濾紙吸干表面水分裝入EP管(每個標本分裝成3～5管) 標記后放入液氮保存備用。剩下的組織放入福爾馬林中送病理科確定組織學類型。

1.3.2 大鼠結腸腫瘤模型的構建及標本處理 選用SD大鼠55只，以二甲基肼(DMH)建立結腸腺瘤-腺癌模型。并隨機分為5組：DMH組15只，干預組(DMH+Celecoxib組、DMH+Zileuton組、DMH+Celecoxib+Zileuton組，每組10只)，對照組10只。DMH組單純予DMH(20 mg/kg)腹腔注射1次/周，并予 生理鹽水灌胃，隔日1次；干預組在予DMH(20 mg/kg)腹腔注射1次/周的基礎上，同時每組分別給予Celecoxib (50 mg/kg)、Zileuton (50 mg/kg)、Celecoxib (25 mg/kg)+Zileuton (25 mg/kg)聯合灌胃，隔日1次；對照組向腹腔內注射生理鹽水1次/周，并予生理鹽水灌胃。每天觀察記錄大鼠生長活動情況。至實驗18周開始，每2周每組隨機處死大鼠1只取材觀察結腸腫瘤生長情況，于22周全部處死。SD大鼠處死前禁食24h，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，然后將麻醉后的大鼠仰臥固定在大鼠解剖板上，腹壁備皮，常規消毒、鋪洞巾，于劍突下沿腹壁切開約2.5cm縱向切口，并沿腹白線剪開腹壁組織，充分暴露腹腔，檢查腹壁、脾臟、肝臟和腹腔淋巴結有無病變，檢查有無腸梗阻及腹水，從小腸和結腸交界處及肛門緣剪下完整的結直腸，并沿結腸系膜剪開大鼠結直腸，用等滲冰生理鹽水清洗血污，并用濾紙吸干表面水分，并稱重(結腸濕重)，仔細觀察大鼠結腸黏膜組織，如粘膜異常則取異常處3塊，如黏膜無異常則腸腔遠端、中段及近端各取3塊；分別液氮速凍后置于-80℃冰箱保存和4%多聚甲醛固定保存。4%中性甲醛固定的標本經石蠟包埋、石蠟切片、HE染色、封片，病理切片分別由2位病理科醫生盲法閱片。

1.4 方法

1.4.1 RT-qPCR法檢測5-LOX、COX-2 mRNA的表達 用Trizol提取標本的總RNA，全波段酶標儀定量提取液中的RNA。按逆轉錄試劑盒操作說明將mRNA合成cDNA。相關引物序列分別為5-LOX(185bp)：上游引物5′AGATGGTAGAGTGCAGCCTGGAG 3′，下游引物，5′GACAATCTTG TTGGCCAGGTTCTTA 3′；β-actin(186bp)：上游引物 5′TGGCACCCAGCACAATGAA 3′，下游引物5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA 3′。 COX-2(119bp)：上游引物5′CCAGCACTTCACGCATCAG 3′，下游引物5′GCTGTCTAGCCAGAGT TTCACC 3′；反應條件：95℃預變性8min， 1Cycle，PCR反應95℃ 15 s，60℃ 1min，40 Cycle。以5-LOX/β-actin、COX-2/β-actin比值×100分別表示5-LOX、COX-2 mRNA表達量。

1.4.2 Western-blot 法測定5-LOX、COX-2蛋白的表達 將留取的各組織標本放入新EP管，加入RIPA和PMSF.NaF充分裂解、勻漿，靜置1 h，12 000 r/min離心30 min，留取上清液。用BCA蛋白定量法測定各組織蛋白含量。以40μg蛋白質為上樣量，常規進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉PVDF膜，脫脂奶粉封閉，分別加入山羊抗人5-LOX多克隆抗體(1∶500)，山羊抗人COX-2多克隆抗體(1∶500)，小鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)作為一抗，4℃過夜，洗膜，加入驢抗山羊IgG(H+L)(均為1∶1 000)和GTVisionTMⅢ抗鼠兔(1∶1 000)作為二抗，洗膜后ECL發光，X線膠片曝光，顯影定影洗片，掃描Western印跡膠片，測定各組蛋白電泳帶積分光密度值，以5-LOX/β-actin、COX-2/β-acting比值表示5-LOX、COX-2蛋白相對表達量。

1.4.3 免疫組織化學法檢測5-LOX、COX-2蛋白的表達 取出組織塊福爾馬林中固定、石蠟包埋，制作切片。梯度脫水、去過氧化物酶、修復抗原、洗滌、封閉，羊抗人5-LOX多克隆抗體(1∶300) 和山羊抗人COX-2多克隆抗體(1∶300)作為一抗，PBS代替一抗作空白對照，4℃過夜，用PBS液洗滌3次，每次5 min，擦干水分而后加入山羊IgG—免疫組化試劑盒ABC即用型(1∶1 000)作為二抗，PBS洗滌去除二抗，DAB顯色，蘇木素復染沖洗，風干后封片，顯微鏡下觀察，表達陽性的細胞為胞漿和(或)核膜出現黃色或棕黃色顆粒，在放大400倍顯微鏡下隨機選擇3個高倍視野，用全自動圖像分析系統掃描拍照，用IPP軟件測定各組織標本的積分光密度(IOD值)進行半定量分析。

1.4.4 ELISA法檢測各組標本中PGE2/LTB4含量 將各組織標本剪碎后加入適量的PBS，充分勻漿使其充分裂解(操作在冰上進行)，冰上靜置30 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，收集各組標本上清液。按照BCA蛋白定量法測定各組織總蛋白含量。將各組織蛋白定量為終濃度為8.4 μg/μL，體積為25 μL的稀釋液進行ELISA測試(按試劑盒操作說明操作), 分別計算出各組標本的PGE2和LTB4含量(μg/L)，每個標本做3個平行孔。

2 結果

2.1 人結直腸不同病理標本5-LOX、COX-2 mRNA及蛋白表達 免疫組織化學結果顯示：正常結黏膜組織細胞中均見到少量的黃色或棕黃色顆粒；在增生性息肉中，見到少量到中等量的黃色或棕黃色顆粒；在腺瘤息肉中，見到中等量到大量的黃色或棕黃色顆粒，在腺癌組織細胞中，見到大量的黃色或棕黃色顆粒。對各組標本5-LOX、COX-2蛋白積分光密度后統計表明，正常黏膜組中表達最低，在腺癌組中表達最高，與其余各組之間比較差異均有統計學意義(P<0.05，見圖1和表2)。

A:正常結腸黏膜; B:增生性息肉; C:腺瘤; D:腺癌；×400。圖1 免疫組織化學檢測中5-LOX、COX-2蛋白在各組織中的表達

RT-qPCR結果顯示：正常結腸黏膜、結腸增生性息肉、結腸腺瘤息肉及結腸腺癌組織中5-LOX、COX-2 mRNA的相對表達量逐漸升高，以腺癌組織升高最為明顯，各組之間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。特別在腺瘤、腺癌組，與正常結腸黏膜、增生性息肉組相比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。腺癌組5-LOX、COX-2 mRNA表達明顯高于腺瘤組，兩相比較具有統計學意義(P<0.05，見表1)。

組別例數5-LOX mRNACOX-2 mRNA正常1512.72±0.165#23.80±3.96# 增生2557.21±18.22?#128.21±25.95?#腺瘤31235.20±40.07?#296.73±38.39?#腺癌15421.18±67.05? 324.20±45.62?

* ：與正常組比較，P<0.05；#：與腺癌組比較，P<0.05。

Western-blot結果顯示：正常腸黏膜組中出現無表達或弱表達，在腺瘤性息肉及腺癌組織表達明顯增加，以腺癌組織中最為明顯。與其余各組之間比較差異有統計學意義(P<0.05，見圖2和表2)。

A:正常組;B:增生組;C:腺瘤組;D:腺癌組。圖2 5-LOX、COX-2蛋白在不同組中的表達情況

2.2 各組大鼠結腸腺瘤-腺癌發生生長情況，5-LOX、COX-2 mRNA表達及PGE2、LTB4含量

2.2.1 結腸腺瘤-腺癌發生生長情況 實驗組及干預組共45只大鼠，第3周DMH+Celecoxib組死亡1只，第4周DMH組死亡2只，出現腹壁潰爛，死亡率5.54%，尸檢未發現結直腸黏膜病變，不計入有效動物。DMH+Celecoxib組、DMH+Zileuton組、DMH+Celecoxib+Zileuton組和DMH組大鼠逐漸出現食欲減退、體重增長緩慢、活動較前減少，且毛發稀疏、發黃，光澤差，后期有部分大鼠出現腹瀉。對照組10只大鼠精神狀態好，食欲可，活動佳，體重增長良好，毛發色澤光亮，無死亡。于18、20、22周分別處死并解剖各組大鼠，除對照組未見腫瘤生長外，其余各組大鼠結腸共發現腫瘤結節94枚，其中結腸腺瘤90枚，結腸腺癌4枚(見表3)。

組別例數5-LOX免疫組化Western-blotCOX-2免疫組化Western-blot正常158.722±3.655#0.158±0.045#6.100±1.078#0.212±0.065#增生2510.528±2.434?#0.207±0.061#384.927±58.48?#0.343±0.095?#腺瘤316707.865±838.978?#0.409±0.107?#434.481±41.846?#0.527±0.142?#腺癌157603.092±1052.067?0.672±0.154?801.264±163.977?0.626±0.158?

*：與正常組比較，P<0.05；#：與腺癌組比較，P<0.05。

組別例數發生腫瘤大鼠數(只)腺瘤數(枚)腺癌數(枚)腫瘤直徑(mm)結直腸濕重(g)DMH+Celecoxib 951503.52±0.96?4.20±0.52?#DMH+Zileuton 1061713.71±0.98?4.55±0.64?#DMH+Celecoxib+Zileuton 1051603.24±0.85?4.09±0.50?#DMH 13114234.28±1.025.13±0.49#對照1000003.51±0.49

*：與DMH組相比較，P<0.05；#：與對照組相比較，P<0.05。

2.2.2 各組大鼠5-LOX、COX-2 mRNA表達 RT- qPCR檢測的結果顯示COX-2、5-LOX mRNA在各組中均有表達，以DMH組最高、對照組較低。與其余各組間比較差異有統計學意義P<0.05，見表4)。

組別COX-2 mRNA5-LOX mRNADMH+Celecoxib 1.412±0.126?# 2.266±0.041?#DMH+Zileuton 1.995±0.211?#1.551±0.031?#DMH+Celecoxib+Zileuton 1.435±0.052?#1.503±0.080?#DMH 4.330±0.198?3.632±0.130?對照 1.058±0.07411.013±0.076

*：與對照組比較P<0.05；#：與DMH組比較P<0.05。

2.2.3 各組大鼠結腸標本中PGE2、LTB4含量比較 ELISA法檢測結果顯示各組結直腸組織中PGE2、 LTB4的含量均高于對照組(P<0.05)，以DMH組最高(P<0.05，見表5)。

組別PGE2含量(pg/L)LTB4含量(pg/L)DMH+Celecoxib568.72±17.68?#452.59±8.82?#ΔDMH+Zileuton 647.97±15.22?#Δ 387.45±11.59?# DMH+Celecoxib+Zileuton561.48±9.88?#384.30±5.80?# DMH 708.46±18.90? 567.42±10.21? 對照 362.10±5.48127.18±3.31

*：與對照組比較P<0.05；#：與DMH組比較P<0.05；Δ：與DMH+Celecoxib+Zileuton組比較P<0.05。

3 討論

花生四烯酸、多不飽和脂肪酸酶代謝是通過環氧合酶和脂氧合酶2條途徑來實現，產生具有多種生物活性的脂類終產物類花生酸類物質，這些活性物質在維持正常機體心血管系統動態平衡、消除炎癥反應及免疫調節中起著重要作用[4-5]。研究表明，LOX 有5-LOX，8-LOX，12-LOX，15-LOX四型，其中15-LOX 可使腫瘤的發生與發展有關，相反8-LOX，12-LOX，15-LOX能促進細胞分化，抑制腫瘤細胞的增殖，具有抗癌作用[6-7]。 COX可分為COX-1、COX-2兩個亞型。COX-1在生物體內恒定表達，參與維持有機體正常的生理功能，然而COX-2在正常組織中不表達或微量表達，其表達增加與炎癥及腫瘤有關[8]。

5-LOX是體內催化花生四烯酸生成生物活性物質5-HETE和LTB4的關鍵酶，普遍存在于人的各類組織及血液細胞中，在正常組織中表達很甚微，主要分布于白細胞、巨噬細胞和肥大細胞中。當組織發生病變時表達增多，甚至過度表達。Tang 等[9]研究認為5-LOX與人體的卵巢、腦、心血管、肺、肝、胰腺等組織的許多疾病有關，其異常表達往往會促進疾病的發生和發展。近年來國內外多方面研究證實5-LOX表達上調參與多種腫瘤的發生和發展。Wen等[10]發現增加低氧的卵巢癌細胞中的5-LOX的代謝產物5-HETE和白三烯可促使腫瘤相關巨噬細胞的浸潤。Zhou等[11]發現在胰腺癌組織中5-LOX表達增加水平與腫瘤淋巴結轉移及腫瘤TNM分期相關。Wasilewicz等[12]采用免疫組織化學方法對111例不同病理組織學類型的結腸息肉研究中發現， 5-LOX表達與息肉的大小、高級別上皮內瘤變、絨毛狀和管狀腺瘤及組織學位置有關，認為5-LOX過渡表達在結腸癌致病過程中起著重要作用。Gounaris等[13]5-LOX抑制劑齊留通能抑制患息肉病老鼠腸息肉減少和息肉相關性炎癥。本研究通過RT- qPCR、免疫組化染色及Western-blot檢測5-LOX基因和蛋白在正常結腸黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉及腺癌組織中表達情況，其結果顯示5-LOX從低表達逐漸升高，在腺瘤性息肉或腺癌組織中出現了過表達，以腺癌組織更為明顯。在DMH結腸腺瘤-腺癌動物模型中，齊留通能抑制5-LOX mRNA高表達及LTB4產生，減少實驗鼠腺瘤及腺癌發生及生長，與DMH組相比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

COX-2催化體內的花生四烯酸生轉化為前列腺素限速酶，研究證實COX-2如食管癌、結直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中存在表達升高或過度表達[14-16]。COX-2參與致癌過程主要跟下游產物PGE2有關，其機制主要包括[17]：①增加VEGF, bFGF, 和 PDGF含量促進血管生成；②增加bcl-2和Akt活性抑制細胞凋亡；③增加基質金屬蛋白酶促進細胞轉移；④降低細胞因子的產生和NK細胞活性進而降低免疫監視。使用塞來昔布作用于體外培養的胃癌細胞BGC-823以時間和劑量抑制細胞的增殖和降低COX-2表達及PGE2的分泌[18]。家族性腺瘤性息肉病患者在結腸切除后服用非甾體抗炎藥舒林酸和COX-2抑制劑塞來昔布可減輕息肉病病情[19]。在我們的臨床研究中發現鴉膽子油乳注射液聯合5-氟尿嘧啶+四氫葉酸鈣治療中晚期大腸癌病人的血清中COX-2 和 PGE2水平是降低的[20]。本研究結果顯示：COX-2 mRNA和蛋白在正常結腸黏膜中呈微表達或表達缺失，在增生性息肉、腺瘤息肉及腺癌中從表達均逐漸升高，在腺瘤組織和腺癌組織中過度表達。在DMH結腸腺瘤-腺癌動物模型中，塞來昔布能明顯抑制COX-2 mRA表達及PGE2產生，減少實驗鼠腺瘤及腺癌發生及生長，與DMH組相比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

近年來，5-LOX和COX-2在腫瘤中的相互表達關系及其作用引起一些學者們的關注。Knab等[21]研究顯示COX-2和5-LOX能促進胰腺癌細胞的增殖，且在能體外培養的胰腺癌細胞株中發現COX-2和5-LOX在基因和蛋白兩個層面上表達均上調，當其受到阻斷時，細胞增殖也隨之停止。Ganesh等[22]通過外培養分別表達5-LOX和不同水平的COX-2的3種(HCA7, HT-29 & LoVo)結腸癌細胞株研究后認為在腫瘤致病過程中， COX-2和5-LOX途徑同時并存，單用環氧合酶抑制劑療效仍就不理想或無效。而在體外動物實驗研究發現，5-LOX/COX雙重抑制劑利克飛龍比同劑量的塞來昔布更有效的抑制小腸和結腸腫瘤的形成[22]。從本實驗究結果中同樣看到，5-LOX和COX-2在人體正常結腸黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉及腺癌組織中同時存在表達，并隨著病理組織損害的加重(正常黏膜→腺瘤→腺癌)，其表達逐漸上調，在動物實驗中，COX-2、5-LOX及其PEG2、LTB4在正常組織-結腸腺瘤-腺癌發生發展過程中表達逐漸增加，應用COX-2/5-LOX抑制劑，可使COX-2/5-LOX mRNA及代謝產物PGE2/LTB4的減少，抑制結腸細胞增殖，有抑制結腸腺瘤-腺癌發生發展的趨勢。有趣的是，在聯合使用塞來昔布、齊留通時，無論是5-LOX mRNA/COX-2 mRNA表達、PGE2/LTB4以及結腸腺瘤-腺癌的發生生長情況，與單用塞來昔布/齊留通組相比較，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。但齊留通組中COX-2 mRNA表達、PGE2含量明顯高于塞來昔布組及塞來昔布+齊留通組，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。同樣，塞來昔布組中5-LOX mRNA表達、LTB4含量明顯高于齊留通及塞來昔布+齊留通組，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。提示在5-LOX /COX-2代謝途徑之間甚至與其他相關酶代謝通路之間存在交通及代償機制。

綜上所述，在致癌因素作用下，COX-2/5-LOX 能通過上調mRNA及蛋白表達，增加結腸粘膜組織中PGE2/LTB4含量，促進結腸腺瘤-腺癌的發生生長及惡變。COX-2或5-LOX抑制劑能部分抑制致癌劑所致的結腸腺瘤-腺癌的生長，即使二者聯合使用也不能增加抑癌作用。提示COX-2/5-LOX代謝途徑在結腸腺瘤-腺癌發生發展過程中具有一定的作用，二者具有協同性。這為結腸腺瘤-腺癌臨床診治提供實驗依據。