安宮牛黃丸對大鼠急性腦缺血再灌注MMP9、AQP4表達的影響

李繼中，江 艷，曾 艷，顏小庚，顏俊文

(1.遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院 神經(jīng)內科，廣東 珠海 519100；2.遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院 腎內科，廣東 珠海 519100；3.遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院 新生兒科， 廣東 珠海 519100)；4.遵義醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099)

腦卒中已經(jīng)成為我國疾病譜中第一大死亡原因，而缺血性腦血管病變占腦卒中的絕大部分(70%～80%)。血液中的各種栓子(如動脈粥樣硬化斑塊、心臟內的附壁血栓、脂肪栓子等)隨血液進入腦動脈而導致腦內的血管出現(xiàn)部分或完全阻塞，當側支循環(huán)不能代償時，引起該動脈供血區(qū)腦組織缺血性壞死，出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損，如肢體偏癱、言語障礙、吞咽困難等。具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特征，嚴重影響患者生存質量。安宮牛黃丸是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥精品，具有清熱解毒、鎮(zhèn)驚開竅等功效。主要用于神昏譫語，中風昏迷及腦炎、腦出血等疾病[1]，其治療機制尚不明確。本研究旨在探討安宮牛黃丸對急性腦缺血再灌注大鼠腦保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康清潔級SD大鼠50只，平均體重(230±20)g，購自山東省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20140007。實驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境(光照12 h/黑夜12 h，濕度50%左右，溫度24 ℃左右)。

1.2 藥品和試劑 安宮牛黃丸購自北京同仁堂公司；MCAO栓線購自北京沙東生物公司，紅四氮唑(分析純)購自上海山浦化工有限公司。

1.3 儀器 電子分析天平：北京賽多利斯電子天平有限公司；MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)：Millipore Trading Co.ltd；實時熒光定量PCR(RT-PCR)儀：美國BIO-RAD公司。

1.4 動物分組及給藥 50只SD大鼠隨機分成5組：假手術組(假手術+給予1 mL蒸餾水)、模型組(造模+給予1mL蒸餾水)、安宮牛黃丸低劑量組(造模+給予安宮牛黃丸1.0 g/kg)、安宮牛黃丸中劑量組(造模+給予安宮牛黃丸2.0 g/kg)、安宮牛黃丸高劑量組(造模+給予安宮牛黃丸3.0 g/kg)；連續(xù)灌胃給藥4 d后手術制作腦缺血再灌注動物模型，造模成功后連續(xù)予以灌胃給藥2 d。

1.5 實驗動物模型制作 SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100g)麻醉，隨后將麻醉好的大鼠固定在木板上，用碘伏消毒手術周圍皮膚，用手術刀在頸前中間稍偏右切開皮膚，改用止血鉗繼續(xù)往下鈍性分離皮下組織，肌肉，暴露右側頸總動脈，繼續(xù)向遠心端分離，顯露頸內、頸外動脈分叉部，在動總動脈、頸外動脈下放置絲線，將頸總動脈近心端和頸外動脈分別結扎，使用動脈夾將頸內動脈夾閉，用小眼科剪刀在頸總動脈與頸內動脈之間剪開一個小口，從小切口往里緩慢插入MACO線，阻斷大腦中動脈(長度為：以頸內動脈和外動脈的交叉處作為標志，往遠心端插入約2.0 cm)，阻斷1 h后將MACO往外拔出約1 cm并剪斷，將大鼠放回鼠籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.6 神經(jīng)功能評分 大鼠手術后48 h, 根據(jù)其行為及癱瘓情況進行評分(評分方法參照文獻1)，共分為6 個等級(0～5分)。0：大鼠完全正常；1：左前肢不能完全伸直；2：左前肢行走偏向左側; 3：向左側旋轉行走;4：原地左旋; 5：左側肢體不能活動。

1.7 測定腦梗死體積 手術后48 h相繼斷頸法處死大鼠，立即剝離出完整大腦，放入-20℃冰柜冰凍約18 min，將冰凍過的大腦取出后用薄刀片冠狀平均切成5張薄片，每片厚度約3 mm，輕輕放入玻璃平皿中(玻璃平皿事先盛有1%TTC溶液)，隨后放置烤箱中37℃孵育約30 min(每隔5分鐘翻轉一次)，梗死區(qū)呈白色，非梗死區(qū)被染成鮮紅色。染色穩(wěn)定后，倒掉TTC溶液，用生理鹽水漂洗2次，棄去，加入10%甲醛溶液，固定24 h后照相，利用多田公式[體積=π/6×長(cm)×寬(cm)×高(cm)]計算腦梗死體積。

1.8 腦組織含水量 處死大鼠后取大腦，置于電子分析天平上稱濕重，隨后放在玻璃瓶中，置烤箱中烘干至恒重，電子分析天平上稱干重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.9 RT-PCR測定腦組織MMP9 mRNA、AQP4 mRNA的表達 取梗死區(qū)域腦組織50 mg左右加1.0 mL trizol液，參照trizol說明書提取RNA，純化并測定濃度合格后逆轉錄，隨后加樣置于實時熒光定量PCR(RT-PCR)儀進行PCR擴增，AQP4 的 正 向 引 物 序 列 為 5’-GTGCTAGGAAACTGATATG-3’，反向引物序列為 5’-TCTGGTGTAGTACATTCAA-3’。MMP9 的 正 向 引 物 序 列 為 5’-CAATCCTTGCAATGTGGATG-3’，反向引物序列為 5’-CAATACCGACCGTCCTTGAA -3’。反應條件(預變性95 ℃10 min ,50 ℃ 2 min ；PCR反應95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min 40 Cycles)，采用2ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 安宮牛黃丸可以降低神經(jīng)功能評分 與假手術組相比較，模型組的評分增高明顯(P<0.05)，表明實驗動物模型制作成功；與模型組相比較，安宮牛黃丸各組均降低神經(jīng)功能評分(P<0.05)，與模型組比較，低、中、高劑量組均有統(tǒng)計學意義，表明安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷有保護作用(見表1)。

組別神經(jīng)功能評分假手術 0模型 4.5±1.2#安宮牛黃丸低劑量 2.8±1.0?安宮牛黃丸中劑量 2.4±1.1?安宮牛黃丸高劑量 2.6±1.3?

#：與假手術組比較,P<0.05;*：與模型組比較,P<0.05。

2.2 安宮牛黃丸可以減少腦梗死體積 各組大鼠腦梗死切片情況見圖1。與假手術組相比較，模型組梗死體積較大(P<0.05)，表明模型成功；與模型組相比，安宮牛黃丸組均能減少腦梗死體積(P<0.05)，表明安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷均有保護作用，以中劑量組效果更佳(見表2)。

A：假手術組；B：模型組；C：安宮牛黃丸低劑量組；D：安宮牛黃丸中劑量組；E：安宮牛黃丸高劑量組。圖1 1%TTC 染色后的大鼠腦組織切片

組別腦梗死體積(cm3)假手術 0模型 0.130±0.016#安宮牛黃丸低劑量 0.080±0.014?安宮牛黃丸中劑量 0.076±0.018?安宮牛黃丸高劑量 0.079±0.020?

#：與假手術組比較,P<0.05;*：與模型組比較,P<0.05。

2.3 安宮牛黃丸可以減輕梗死周圍腦水腫 從表3結果可以看出，大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫情況中，與模型組相比，安宮牛黃丸組均能減輕腦水腫(P<0.05)，減輕腦水腫效果：中劑量組>高劑量組>低劑量組。

組別腦組織含水量(%)假手術 0模型 84±1.21#安宮牛黃丸低劑量 78±1.30?安宮牛黃丸中劑量 76±0.98?安宮牛黃丸高劑量 77±0.87?

#：與假手術組比較,P<0.05；*：與模型組比較,P<0.05。

2.4 梗死區(qū)腦組織MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達 各組大鼠腦組織MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達情況見表4。與假手術組相比較，模型組MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達量較高(P<0.05)，表明模型成功；與模型組相比，安宮牛黃丸組均能減少腦組織MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達(P<0.05)，表明安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷均有保護作用(見表4)。

組別MMP9 mRNAAQP4 mRNA假手術 0.05±0.010.65±0.11模型 0.18±0.02#1.52±0.23#安宮牛黃丸低劑量 0.12±0.02?0.93±0.18?安宮牛黃丸中劑量 0.08±0.01?0.85±0.15?安宮牛黃丸高劑量 0.09±0.01?0.89±0.20?

#：與假手術組比較P<0.05； *：與模型組比較,P<0.05。

3 討論

腦梗死治療關鍵是盡快恢復血供，方法有靜脈溶栓或介入治療等，而據(jù)大樣本臨床觀察，血管再通后很大一部分患者并沒有因此而得到更好的恢復，主要原因就是缺血再灌注使腦組織損傷進一步加重，如何降低腦缺血再灌注損傷成為目前亟待解決的問題。

血腦屏障(Blood brain barrier ，BBB)的完整性有效的保護了腦組織免受破壞，而在缺血缺氧情況下，BBB遭到破壞，導致早期出現(xiàn)細胞毒性腦水腫，隨后出現(xiàn)輕度血管源性腦水腫，進而加重腦梗死患者的病情，從而加速患者死亡[2]，MMP9作為基質金屬蛋白酶家族成員中最重要的一員，參與了BBB破壞過程，在缺血缺氧和炎癥刺激下，MMP9被大量分泌和激活，直接降解BBB的神經(jīng)血管基底層和緊密連接蛋白，導致BBB破壞[3-5]；與此同時，AQP4作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的雙向轉運水分子的選擇性水通道蛋白，參與了腦水腫的發(fā)展和消退，當AQP4表達上調時，可引起神經(jīng)膠質細胞足突水腫，進而使BBB 遭到破壞，導致腦水腫[6-9]。當BBB破壞后，腦組織出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤、血管內皮細胞腫脹，神經(jīng)膠質細胞及細胞間隙水腫，腦組織水分進一步增加，從而使神經(jīng)元壞死[10]。

在本實驗中，SD大鼠腦缺血1 h再灌注48 h后，MMP9 mRNA及AQP4 mRNA的表達顯著增高，激活了BBB的破壞過程，安宮牛黃丸治療組中，腦梗死體積明顯降低、神經(jīng)功能評分明顯改善、腦水腫程度也較模型組減輕，可能與安宮牛黃丸降低MMP9及AQP4 有關。

安宮牛黃丸對腦缺血再灌注損傷有保護作用，其保護作用可能與其抑制MMP9 mRNA、AQP4 mRNA的表達有關。