單細胞測序技術流程及其應用

張子祺 張永康 謝輝 孟凡孝

摘 要：細胞是生命活動的基本單位，是人們的重點研究對象。闡釋生命活動的規律，就必須要對細胞的通訊、免疫、復制、調節等活動的生化途徑進行深入研究。不同細胞之間存在“異質性”，但傳統上的研究方法無法突破“單細胞”這一條件的限制，因此實驗結果反映的更是多個細胞之間的平均結果，所以有些疾病如“癌癥”無法被精確地檢測出來，相反單細胞分析可以更精確地了解每個細胞之間的表達情況，將會應用在很多領域例如：神經生物學、干細胞生物學等方面，本文將歸納單細胞分析的基本流程，并列舉些許應用實例。

關鍵詞：單細胞測序;應用;流程

1 緒論

傳統上的細胞分析方法局限于細胞群，這種方法存在一定局限性，細胞群所轉錄或表達的產物代表這個細胞群平均水平，然而低分子量的物質卻難以檢測到，因此我們所得出的結論就不能應用于單個細胞，就不能解釋很多現象，例如：同一種藥物施加于同一組織的相鄰的細胞具有不同的功效。單細胞分析將研究對象轉移至單個細胞，更適合于細胞的‘異質性研究，其在神經生物學、醫藥方面、微生物、發育生物學等各個領域具有廣泛的應用前景。

2 基本流程

2.1 分離

分離、獲得單細胞是單細胞測序的第一步，現在有很多分離單細胞的技術，例如：顯微操作技術、激光捕獲切割技術、熒光激活細胞分選、微流控技術等等。[2]熒光激活細胞分選的優點是準確度高，通量大，缺點是需要大量的懸浮細胞作為材料;顯微操作技術優點是操作方便成本低，缺點是通量低并且容易損害細胞;激光捕獲切割優點是保護要捕獲的細胞，不破壞細胞周圍組織結構，缺點是價格高昂;[3]梯度稀釋法的優點是價格低廉，但是容易出現分離錯誤。

2.2 擴增

（1）單細胞全基因組擴增技術。首先，將所獲得的單細胞溶解，獲得微量DNA，其次利將所得到的微量DNA進行高效擴增，從而獲得高度覆蓋的基因組。其中，擴增技術分為兩類，有如‘兼并核苷酸引物技術這類基于PCR的全基因組擴增技術，以及如：‘多重置換擴增技術這類不基于PCR的全基因組擴增技術。不同的擴增技術適用于不同的測序、分析技術。

（2）單細胞轉錄組擴增技術。將單個細胞的mRNA通過PCR逆轉錄為cDNA，再進行擴增，從而獲得大量的轉錄組。SMART是現今最常用的一種方法，當然還有其他諸如：Phi29聚合酶擴增技術、STRT技術等轉錄組擴增技術。

2.3 測序

單細胞測序涉及到兩個方面：轉錄組和基因組，測序過程中針對單個細胞的DNA和RNA分別進行分析與比較，從而找到基因組和轉錄組之間的差異與變化。[7]

3 應用

3.1 單細胞分析技術在腫瘤研究方面的應用

腫瘤細胞存在異質性，從細胞群的角度觀察腫瘤細胞，無法找出不同細胞之間的差異，從而會限制對腫瘤細胞的研究。通過單個腫瘤細胞的測序，我們可以研究腫瘤發生、新陳代謝的過程，同時認識各種腫瘤細胞之間及個體之間存在差異的起因和腫瘤疾病產生的根源所在。

3.2 單細胞分析技術在人類細胞圖譜計劃中的應用

人類細胞圖譜計劃的意義在于，它將用于識別細胞類型，解釋遺傳變異體，定義病理表征和標記，并促進相關試劑如抗體、探針等的開發，細胞圖譜的解析需要結合多種技術手段，其中建立單細胞分析平臺對細胞進行分離和鑒定是構建細胞圖譜的前提。

3.3 單細胞測序技術在神經生物學中的應用

有研究表明當神經干細胞向神經細胞進行分化時，不同的神經細胞之間存在著差異。（長散在核元件會通過反轉錄轉座在基因組內發生跳躍形成新的插入，而且每個神經元可能含有獨特的長散在核元件插入，[2]因此神經細胞也適用于細胞異質性的研究。

3.4 單細胞測序技術在醫藥方面的應用

單細胞分析應用在了很多醫藥研究方面的領域，借助這一技術，研究者們可以在單細胞水平研究許多疾病和生物進程，包括神經細胞基因組異質性、癌變和腫瘤進化、腫瘤轉移中的循環腫瘤細胞、早期胚胎發育和不可培養的細菌等，極大改變了我們對這些生物現象的理解。

3.5 單細胞測序技術在微生物方面的應用

宏基因組技術，所展現的是環境中全部的微生物分析結果，該結果代表數量上占據優勢的微生物。而單細胞測序技術可以將從環境中所得的微生物進行逐一分析，從可以將基因組分析具體到單個微生物，因此，所得到的結果更貼近于個體，發現新的微生物幾率便會更高。[3]

4 結語

單細胞分析技術和宏基因組技術相比，其不同之處在于可以分析單個細胞的基因表達情況，更好地比較不同單個細胞之間的差異，從而揭示傳統上難以解決的問題，如：為什么相鄰的細胞對同種藥物反應不同;為什么早期癌癥難以被診斷。當然它也有當今難以解決的問題：擴增偏倚性，敏感性低下，容易污染等等。其次，我們可以看到單細胞分析的應用前景相當廣泛例如：人類細胞圖譜計劃、神經生物學、醫藥方面、微生物、發育生物學等等領域，都已有研究成果或者有一定的研究潛力。

相信隨著細胞分選技術的改進，以及全基因組及全轉錄組擴增技術的不斷完善，單細胞分析的靈敏度以及準確度將會進一步提升，該技術也會更廣泛的被應用在各個領域中。

參考文獻：

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作者簡介：張子祺（1998-），男，山東濟南人，本科在讀，山東農業大學生物工程專業。