甲基化p16基因及其表達蛋白在膠質瘤中表達的Meta分析

胡心儀 陳柏森 任詩齊 王子恒 曹翔宇 王為 楊宇辰 朱蕙霞

摘要：目的 系統分析p16基因甲基化、P16蛋白表達與膠質瘤發生發展的關系。方法 計算機檢索PubMed、中國期刊全文數據庫（CNKI）、維普、萬方數據庫等數據庫，各數據庫檢索時間均為建庫截至2018年2月。嚴格遵循文獻篩選標準，收集有關p16基因甲基化、P16蛋白表達與膠質瘤發生發展關系的隨機對照實驗（RCT），用R語言軟件以相對危險度（RR）及95%可信區間（CI）為效應指標進行Meta分析。結果 最終納入文獻21篇，Meta分析的結果顯示：p16基因甲基化與膠質瘤病理分級的表達差異（RR=0.53；95%CI=0.34～0.81；P<0.01）、膠質瘤組和對照組中的P16蛋白表達的差異（RR=0.53；95%CI=0.47～0.60；P<0.01）、P16蛋白表達與膠質瘤病理關系的表達差異（RR=1.74；95%CI=1.35～2.26；P<0.01）均有統計學意義。結論 p16基因甲基化隨著膠質瘤病理分級增高而增高，P16蛋白表達隨著膠質瘤病理分級增高而降低。因此，可將p16基因甲基化程度及P16蛋白表達率作為聯合指標判斷腦膠質瘤的發生發展情況。

關鍵詞：p16；Meta分析；膠質瘤；甲基化；臨床治療

膠質瘤是一種惡性腦腫瘤，約占全部中樞神經系統腫瘤的60%[1]，具有生長速度快、侵襲力強、有效規避人體免疫系統清除等特點。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）將膠質瘤分為Ⅰ～Ⅳ級[2]，其中Ⅰ～Ⅱ級為低惡性程度膠質瘤，Ⅲ～Ⅳ級為高惡性程度膠質瘤。明確膠質瘤的分級有助于治療方案的制定及疾病發展情況的判斷，故本文將Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤設立為WHOⅠ～Ⅱ組，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤設立為WHO Ⅲ～Ⅳ組進行研究。

現有的治療方案包括手術切除、放療、化療選用以及抗腫瘤藥物的使用難以治愈膠質瘤[3～4]。因此，尋找新的路徑對膠質瘤進行診斷和治療是當務之急。目前，研究提示p16基因與膠質瘤發生發展具有密切聯系[5～8]。p16基因是一種新的抑癌基因，通過直接參與細胞的調控，負調節細胞的增殖與分裂[9]。p16基因也被稱作是細胞周期的剎車裝置，p16基因的失活會促使細胞的惡性增殖，從而導致惡性腫瘤的發生。啟動子區CpG島甲基化是p16基因失活的一種重要機制，p16基因甲基化后產生的P16蛋白結構改變、功能異常。已有相關文獻研究了p16基因甲基化、P16蛋白表達與膠質瘤發生發展的關系[10～30]，但單個研究樣本量小，不能指出p16基因與腦膠質瘤發生發展之間的確切關系。因此，本文選取關于p16基因甲基化、P16蛋白表達與膠質瘤發生發展的關系的隨機對照實驗（randomized controlled trial，RCT），采用Meta分析的方法，系統評價p16基因甲基化、P16蛋白表達與膠質瘤發生發展的關系，從而為膠質瘤早期的診斷和治療提供實踐依據。

1 材料與方法

1.1資料來源 檢索PubMed、中國期刊全文數據庫（CNKI）、萬方、維普數據庫等，篩選國內外p16基因與人腦膠質瘤相關的RCT，中文檢索詞為“神經膠質瘤”、“人腦膠質瘤”、“惡性膠質瘤”、“膠質細胞瘤”、“星形膠質瘤”、“間膠質瘤”、“少突膠質細胞瘤”、“膠質瘤”、“p16基因”、“P16蛋白”、“甲基化”，英文檢索式為（（ARF）or（CDK4I）or（C-DKN2）or（CMM2） or（P19）or（P19ARF）or（T-P16））。檢索時限截至2018年2月，所有檢索策略通過多次預檢索后確定。

1.2文獻納入與排除標準 納入標準 ①所有納入的研究病例均需有完整的臨床病例數據；② 文獻為病例實驗研究；③病例術前未進行化療或放療；④統計方法恰當，數據可靠，結果表達清晰明確，可計算出相對危險度（RR）及95%可信區間（CI）。排除標準 ①文題、摘要與p16及膠質瘤無關；②純綜述或論述、評述類文獻、動物實驗研究及兒童相關研究文獻；③不能通過原始文獻內容或摘要推算出數據的研究；④未設立對照組的文章；⑤研究語種僅限于中、英文。

1.3質量評價 采用Jadad量表的質量評價標準對納入研究的文獻進行質量評分，評分項包括隨訪情況、意向性分析、是否采用盲法、是否隨機分配、基線可比性，每項滿分10分，其中，高于25分的文獻為高質量文獻，低于25分的為低質量文獻。

1.4統計學分析 按Meta分析的要求整理、核對納入文獻中的數據，用R語言軟件以相對危險度（RR）及95%可信區間（CI）為效應指標進行Meta分析。各納入研究結果間的異質性采用χ2檢驗，若P>0.05，采用固定效應模型進行分析，若P<0.05提示存在統計學異質性，并分析異質性來源，確定是否能采用隨機效應模型。

2結 果

2.1文獻檢索結果以及納入研究的基本特征 初次檢索得到文獻3062篇，通過閱讀題名和摘要后排除文獻2894篇，初篩共得到168篇文獻。調閱全文，按篩選標準最終納入21個RCT。（圖1）

2.2納入研究的方法學質量評價 本研究納入的文獻有21篇，所有研究均采用了隨機分組法和盲法，8篇文獻明確描述了意向性分析，4篇文獻描述了基線可比性，其中高質量文獻20篇，低質量文獻1篇。

2.3 Meta分析結果

2.3.1 p16基因甲基化與膠質瘤病理分級的Meta分析 納入的10篇文獻[21～30]中均報告了p16基因甲基化與膠質瘤病理分級關系。其中WHOⅠ～Ⅱ組中p16基因甲基化的共49例，WHO Ⅲ～Ⅳ組中p16基因甲基化的共119例，各項研究間具有統計學異質性（P=0.03，I?=51%）。因此，可以選用隨機效應模型來進行Meta分析。結果提示，WHOⅠ～Ⅱ組和WHO Ⅲ～Ⅳ組中的p16基因甲基化差異具有統計學意義（RR=0.53；95%CI=0.34～0.81；P<0.01）（圖2）。

2.3.2 P16蛋白表達情況與膠質瘤病理分級關系的分析結果：納入的11篇文獻中[10～20]均報告了P16蛋白表達情況與膠質瘤病理分級關系。其中WHOⅠ～Ⅱ組中P16蛋白表達陽性的共238例，WHO Ⅲ～Ⅳ組中P16蛋白表達陽性的共130例，各項研究間具有統計學異質性（P<0.01，I?=58%）。因此，可以選用隨機效應模型來進行Meta分析。結果提示，WHO Ⅰ～Ⅱ組和WHO Ⅲ～Ⅳ組中的P16蛋白表達差異具有統計學意義（RR=1.74；95%CI=1.35～2.26；P<0.01）（圖3）。

3 討 論

腦膠質瘤是最常見的原發性顱腦腫瘤，其惡性增長的發生與腫瘤細胞周期失控直接相關。p16基因是細胞周期中的基本基因，直接參與細胞的調控，負調節細胞增殖與分裂。有研究發現腦膠質瘤中p16基因的啟動子區域發生了CpG島甲基化[31]，引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，最終導致p16基因及其產物P16蛋白表達異常。但由于單個研究樣本量小，未能指出p16基因及P16蛋白與腦膠質瘤發生發展之間的詳細關系。因此，本文研究p16基因甲基化及P16蛋白表達與膠質瘤病理分級的關聯強度，系統評價p16基因甲基化、P16蛋白表達與膠質瘤發生發展的關系。

關于P16蛋白在膠質瘤中的表達情況，本研究納入的文獻中發現，P16蛋白表達與膠質瘤的病理分級呈負相關，即膠質瘤病理分級越高，P16蛋白表達越低（RR=0.53，P<0.01）。p16基因甲基化與膠質瘤病理分級的研究提示p16基因甲基化與膠質瘤的病理分級呈正相關，即膠質瘤的病理分級越高，p16基因甲基化程度越高（RR=0.53，P<0.01）。該Meta分析表明p16基因甲基化和P16蛋白表達在不同等級的膠質瘤中都具有明顯的差異性，在WHOⅠ～Ⅱ組中，p16基因甲基化程度低，而P16蛋白表達率高；在WHO Ⅲ～Ⅳ組中，p16基因甲基化程度高，而P16蛋白表達率低。因此可考慮將P16蛋白表達情況和p16基因甲基化程度作為聯合指標來反應膠質瘤的發生發展情況，從而提高早期臨床診斷的靈敏度。

p16基因及表達產物P16蛋白對細胞周期的抑制作用和對細胞生長調節的影響使它們極有可能成為將來腫瘤基因治療的候選靶點。本文Meta分析結果表明，p16基因甲基化越明顯，腦膠質瘤惡性程度越高。提示在治療方面可以考慮將特異性逆轉p16基因高甲基化狀態，來恢復p16基因正常表達作為一種治療手段，為臨床難以治愈腦膠質瘤的治療方案提供新思路。

參考文獻：

[1] Hardell L，Carlberg M，Hansson Mild K.Epidemiological evidence for an association between use of wireless phones and tumor diseases[J]. Pathophysiology，2009，16（2-3）：113-122.

[2] David N. Louis，Hiroko Ohgaki，Otmar D. Wiestler.The 2007 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System[J]. Acta Neuropathol，2007，114（2）：97–109.

[3] Roci E，Cakani B，Brace G，et al. Platinum-based chemotherapy in recurrent high-grade glioma patients：retrospective study[J]. Med Arch，2014，68（2）：140-143.

[4] Feng B，Hu P，Lu SJ，et al. Increased argonaute 2 expression in gliomas and its association with tumor progression and poor prognosis[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（9）：4079-4083.

[5] Gao Y1，Li L2，Song L.Expression of p16 and survivin in glioma and their correlation with cell proliferation[J]. Oncol lett，2015，10（1）：301-306.

[6] Song T，Wu J，Fang F，et al. Correlation analysis between the expression of P21WAF1/CIP1，P16 proteins and human glioma[J]. Clin Exp Med，2008，8（3）：151-157.

[7] Kuo-Sheng Hung，Chi-Yuan Hong，Jihjong Lee. et al.Expression of p16INK4 A Induces Dominant Suppression of Glioblastoma Growth in Situ through Necrosis and Cell Cycle Arrest[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，269（3）：718-725.

[8] Schmidt EE，Ichimura K，Reifenberger G，et al. CDKN2（p16/MTS1）gene deletion or CDK4 amplification occurs in the majority of glioblastomas[J].Cancer Res，1994，54（24）：6321-6324.

[9] Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J]. Nature，1993，366（6456）：704-707.

[10] 公茂青，梁傳聲，王勇，等.人腦神經膠質瘤中p16、p21～（WAF1/CIP1）蛋白表達的研究[J].解剖科學進展，2003，9（02）：119-121.

[11] 馬云富，馮啟建.人腦膠質細胞瘤組織中P16和P53的表達[J].鄭州大學學報（醫學版），2006，50（02）：367-368.

[12] 邵冰水，毛沖沖，翟廣，等.STAT3和P16在人腦神經膠質瘤中的表達及臨床意義[J].河南醫學研究，2015，24（02）：7-9.

[13] 孫繼平，趙耀東，樓美清.C-myc及P16在人腦膠質瘤中的表達及其意義[J].同濟大學學報（醫學版），2012，33（01）：24-26.

[14] 文志華，趙時雨，李志強，等.Cyclin D_1和p16、p27在腦膠質瘤中的表達及其與PCNA的相關性[J].中國免疫學雜志，2003，19（10）：697-700.

[15] 唐曉平，毛伯鏞，漆健，等.CyclinD_1，P16在膠質細胞瘤進程中的表達及相關性[J].河南腫瘤學雜志，2003，14（05）：322-325+391.

[16] 劉波，李運海，欒文忠，等.P16蛋白和Ki-67抗原在人腦膠質瘤中的表達及其意義[J].北京大學學報（醫學版），2003，45（02）：223-225.

[17] 胡維維，王輝，譚家駒，等.P16蛋白及c-erbB-2蛋白在腦膠質瘤中的表達及意義[J].廣東醫學，2000，38（12）：1028-1029.

[18] 屈洪艷，蔡潤，朱正鵬.P16和survivin蛋白在腦膠質瘤中的表達及其臨床意義[J].國際檢驗醫學雜志，2011，32（04）：466-467.

[19] 劉飛，章翔，曹衛東，等.P16與P53蛋白在腦膠質瘤中的表達及意義[J].中國臨床神經外科雜志，1999，4（02）：39-40+43.

[20] 甘懷勇，俞嵐，陶儀聲，等.p16在人腦膠質瘤中的表達及其意義[J].蚌埠醫學院學報，2007，32（03）：259-261.

[21] 李顯雄，徐培坤，李式浩，等.檢測血漿中p16及CDO1基因甲基化在膠質瘤診斷中的價值[J].安徽醫科大學學報，2017，52（04）：593-596.

[22] 王喆，曹培成，張振興，等.p16基因CpG島甲基化與膠質瘤生物學特性的關系[J].中華神經外科疾病研究雜志，2007，7（04）：311-314.

[23] 羅藝，陳堅，呂元.p16基因啟動子CpG區甲基化與人腦膠質瘤臨床病理特征的關系[J].復旦學報（醫學版），2004，49（05）：477-480.

[24] 張振興，王道奎，管立學，等.p16基因啟動子區CpG島甲基化與腦腫瘤的相關性研究[J].中華神經外科雜志，2007，23（10）：779.

[25] 朱沛傳，陳江瑛，張素平.p16基因啟動子在腦膠質瘤患者中的異常甲基化及意義[J].現代醫院，2011，11（09）：9-12.

[26] 王成東，王瑞麗，張振興，等.膠質瘤患者血漿與腫瘤組織p16基因甲基化的檢測及意義[J].中國腫瘤臨床，2007，45（17）：992-994.

[27] 翟廣，袁先厚，宋來君.腦腫瘤p16基因缺失、突變及5CpG島甲基化研究[J].腫瘤，2001，27（04）：281-284.

[28] 鄧鵬程，徐培坤，朱立新，等.腦膠質瘤癌組織與外周血中p16甲基化檢測及臨床意義[J].安徽醫科大學學報，2015，31（2）：253-255.

[29] 侯道榮，馬駿，夏龍等.腦膠質瘤組織中p16基因啟動子區CpG島甲基化檢測及其臨床意義研究[J].現代生物醫學進展，2009，9（20）：3890-3893，3889.

[30] Joseph F. Costello，Mitchel S. Berger，H-J. Su Huang et al. Silencing of p16/CDKN2 Expression in Human Gliomas by Methylation and Chromatin Condensation[J]. Cancer Res，1996，56（10）：2405-2410.

[31] Muntener M，Nielsen ME，Romero FR，et al. Long-term oncologic outcome after laparoscopic radical nephroureterectomy for upper tract transitional cell carcinoma [J]. European Urology，2007，51（6）：1639-1644.