提高乳腺癌術中前哨淋巴結冰凍切片質量的研究

劉春榮 張榮菊 田亮

摘要：目的 ?分析淋巴結冰凍切片的影響因素，以提高淋巴結冰凍切片質量。方法 ?收集我院2016年1月～2018年12月臨床送檢的331例乳腺癌術中前哨淋巴結冰凍切片，通過對取材、包埋、制片等各個環節的分析，探討冰凍制片中出現的問題，總結冰凍切片的操作技巧和改良方法。結果 ?331例前哨淋巴結冰凍活檢中，有2例出現假陰性，石蠟切片病理診斷發現微轉移灶2 mm。其余冰凍切片質量較好，組織結構完整，細胞形態清晰，染色分明，少有冰晶形成。結論 ?通過規范操作細節調整改進，制作高質量冰凍切片，對診斷乳腺癌前哨淋巴結是否轉移特異性較高，是一種較為可靠而快速的診斷方法。

關鍵詞：前哨淋巴結;冰凍切片;乳腺癌;制片

中圖分類號：R361+.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：B ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.18.068

文章編號：1006-1959（2019）18-0190-03

Abstract：Objective ?To analyze the influencing factors of frozen section of lymph nodes to improve the quality of frozen sections of lymph nodes. Methods ?The frozen sections of sentinel lymph nodes in 331 cases of breast cancer were collected from January 2016 to December 2018 in our hospital. Through the analysis of various aspects such as material extraction， embedding， and film production， the problems in frozen film production are discussed， and the operation techniques and improvement methods of frozen section are summarized.Results ?The 331 cases of sentinel lymph node biopsy， 2 cases had false negatives. The pathological diagnosis of paraffin sections revealed a micrometastase of 2 mm. The remaining frozen sections have good quality， complete tissue structure， clear cell morphology， distinct staining， and few ice crystal formations.Conclusion ?It is a reliable and rapid method to diagnose high-quality frozen sections by standardizing the operation details and improving the high specificity of sentinel lymph node metastasis.

Key words：Sentinel lymph node;Frozen section;Breast cancer;Making section

前哨淋巴結（sentinel lymph node，SLN）是原發腫瘤引流區域淋巴結中的特殊淋巴結，是原發腫瘤發生淋巴結轉移所必經的第一批淋巴結，其組織病理學狀態可代表整個區域淋巴結的可能狀態。前哨淋巴結活檢能較準確的評估早期乳腺癌患者的腋窩淋巴結狀態[1]。前哨淋巴結的術中冰凍切片檢查是乳腺癌患者腋窩淋巴結狀態的有效且可靠的預測指標[2，3]，故前哨淋巴結術中冰凍切片準確診斷極為重要。冰凍切片檢查可以最早的了解淋巴結內是否有轉移的腫瘤細胞，以利于確定是否需要徹底掃除腋窩淋巴結或者其它的治療措施。但冰凍切片是在低溫恒冷條件下，使組織迅速冷凍達到一定硬度制成的切片，一般要求15 min內完成，在制片工作中存在局限性，尤其淋巴結組織細胞致密，組織低溫易脆，制片存在困難，故本文將乳腺癌術中前哨淋巴結傳統制片方法加以探討與改進，以期不斷提高淋巴結的術中冰凍切片質量。

1資料與方法

1.1一般資料 ?收集河北醫科大學附屬滄州市中心醫院2016年1月～2018年12月收治的331例臨床原發性乳腺癌女性患者的手術中切除前哨淋巴結送檢病理組織。

1.2方法

1.2.1儀器及材料 ?采用德國產 Leiea CM1950型恒溫冷凍切片機，OCT包埋劑，AAF固定液，蘇木素伊紅染液，梯度酒精，二甲苯。

1.2.2取材 ?術中送檢新鮮淋巴結剔除脂肪組織，沿長軸取材，厚度0.2～0.3 cm，如果淋巴結體積較小，則去除脂肪直接包埋切片。

1.2.3包埋 ?將取材淋巴結置于-18℃冷凍切片機內組織樣本托上，樣本托需提前放置恒溫冷凍切片機內制冷，先加少量包埋劑打底，然后迅速放置組織，在組織周圍二次加包埋劑穩固，待組織固定后，將冷凍錘輕壓在組織表面，使組織和周圍的支撐劑平整，冷卻后切片。

1.2.4制片 ?淋巴結切片厚度4～5 μm，將組織粘附于載玻片下2/3與下1/3交界處，取片完成后立即放入AAF混合固定液（95%乙醇85 ml、40%甲醛10 ml、冰醋酸5 ml）中充分固定[4]。AAF混合固定液能迅速固定染色質，且固定效果均勻，固定時間至少1.5 min，固定后切片充分水洗，harris蘇木素及伊紅染色，梯度酒精脫水二甲苯透明中性樹膠封片。

1.2.5固定冰凍組織塊 ?冰凍制片完成，再發完冰凍報告后冰凍組織塊及時取下投入固定液，繼續下一步石蠟常規脫水處理程序。

2結果

331例前哨淋巴結冰凍活檢中，有2例出現假陰性，石蠟切片病理診斷發現微轉移灶2 mm。余冰凍切片平整，厚薄均勻、無皺折，鏡下淋巴結結構完整，染色鮮明，細胞形態清晰，無腫脹及明顯收縮，無空泡及少有冰晶形成，完全滿足診斷需要（圖1），若操作不當，造成淋巴結結構破碎，組織空洞，細胞擠壓影響閱片診斷（圖2）。

3討論

提高乳腺癌術中前哨淋巴結快速冰凍切片質量，涉及取材、包埋、切片等各個環節。乳腺癌術中送檢前哨淋巴結往往脂肪包裹，由于脂肪組織冷凍效果差，取材盡量剔除脂肪組織，對于難以剔除脂肪組織，可以用吸水吸油擦手紙或者廚房紙輕柔按壓盡量吸去脂肪效果較好，注意動作輕柔勿壓傷細胞。之后沿長軸取材淋巴結，組織厚度≤0.3 cm，注意取材過厚延長冷凍時間，容易產生冰晶，影響鏡下閱片診斷，傳統組織取材厚度≥0.5 cm影響制片效果。

組織包埋時，一般實驗室樣本托在常溫放置，冰凍操作過程中會延長組織與樣本托固定與冷凍時間。本研究中將樣本托提前放置于恒溫冷凍切片機中預冷，可以使組織迅速冷凍。滴加包埋劑放置組織，在組織周圍二次加包埋劑穩固，待組織底部固定后用冷錘按壓，避免重壓組織導致過度變形，實驗發現組織取材薄平整，預冷樣本托，冷錘冷卻按壓可以加速組織冷凍。對于送檢多個淋巴結，需準備多個樣本托分別冷凍，切忌不能將送檢所有淋巴結放到一個組織樣本托制片，增加切片難度。對于個別淋巴結組織體積較小，可以由包埋劑充分包裹制片有利于切出完整帶被膜淋巴結組織，避免卷邊。另外，市售液體膠水可以替代進口包埋劑，切片效果良好，且經濟簡便價格低廉，可以作為很好的替代品[5]。注意包埋劑用量，包裹組織但不可過量，以免延長冷凍時間。

恒溫冷凍切片機一般冷凍工作室溫度控制在-24℃～-20℃，淋巴結組織冷凍后易變脆，切片易碎裂，溫度不能太低，一般在-18℃～-17℃比較合適[6]。我們將冷凍工作室溫度調至-18℃制作淋巴結冰凍切片，對于送檢部分脂肪浸潤淋巴結組織，冷凍難以制片，徠卡 Leiea CM1950 型恒溫冷凍切片機可以啟動單獨樣本頭速凍功能，將冷凍樣本頭溫度下降至-50℃～-35℃切片，切片完成后上調與恒溫冷凍切片機冷凍工作室溫度一致或高于冷凍工作室溫度，以保護壓縮機，提高冰凍切片機使用壽命。

切片時注意動作均勻搖動把手，不可用力過猛，動作輕柔，右手拿載玻片輕輕平穩地壓組織，使其平整地吸附在載玻片上。在貼附組織時可順著一個方向稍微用力輕輕一帶，幫助組織平展，但不可用力過猛牽拉出現組織變形擠壓或者空洞破碎。冰凍取片時注意一次性粘附組織片，傳統手法可能一張載玻片多次粘附動作，這樣雖然粘貼組織多，但前期取片組織鏡下觀察往往易發生退變，可以利用防卷板一次性多切片，然后一起粘附。對于淋巴結懷疑有轉移者，應連續切片間隔取片3～4張，充分顯示不同層面病變做到不遺漏。如在冰凍切片中，淋巴結組織冷凍過脆出現破碎小裂口，或者呈粉沫狀，解決辦法是打開觀察窗戴薄膜手套用手將組織塊暖一下，或將組織取出來在室溫中停留片刻，令其迅速回暖再行切片，這樣就能切出完整連續的切片[7]，注意時間不可過長。

切片完成后應立即將切片放入固定液中，固定的作用是使蛋白質變性、凝固、沉淀，保持細胞、組織原有的形態[8]，及時固定使切片細胞核結構清晰，切忌在室溫中停留干燥再固定，否則容易造成細胞退變，喪失組織原有結構。在室溫高或空氣干燥的情況下，室溫越高，退變速度越快[9]。固定時間要充分，至少1.5 min，固定后水洗也要充分，徹底洗去多余的固定液和包埋劑，注意這兩個時間不可省略。如冰凍取片后吹風機吹干固定，梯度酒精脫水后吹干封片，都易導致細胞退變皺縮。

冰凍制片完成，再發完冰凍報告后冰凍組織塊取出流水沖洗脫離樣本托立即投入10%中性甲醛固定液中，固定組織細胞形態結構，避免組織自溶，保存細胞抗原性不丟失，注意不可以常溫等待自然融化。冰凍組織塊在處理完冰凍報告后常規行石蠟脫水處理程序，組織學制片石蠟病理診斷驗證術中冰凍報告。在331例前哨淋巴結冰凍活檢工作中，發現有2例出現假陰性，石蠟切片病理診斷發現微轉移灶2 mm，冰凍制片未發現，考慮冰凍組織切面淺未切上，總結工作經驗，冰凍制片還需多切面多取片。余冰凍石蠟相吻合，冰凍與石蠟診斷符合率達99.40%。

綜上所述，制作高質量冰凍切片，還需要規范操作，細節調整改進，才能不斷提高冰凍切片質量。術中冰凍切片可以可靠地評估乳腺癌患者前哨淋巴結活檢的狀態，能夠避免大多數女性的二期手術，在早期乳腺癌患者手術中使用前哨淋巴結冷凍切片及冰凍診斷為臨床制定進一步手術方案提供了可靠依據。

參考文獻：

[1]葉春梅，高丹，黃自明，等.前哨淋巴結冰凍切片檢查在乳腺癌手術中的應用價值[J].臨床外科雜志，2015，23（10）：763-765.

[2]Banuelos-Andrío L，Rodríguez-Caravaca G，Argüelles-Pintos M，et al.Diagnostic validity of the intraoperative analysis in frozen section of the sentinel lymph node in the urgical management of breast cancer[J].Rev Esp Med Nucl Imagen Mol，2014，33（4）：193-198.

[3]Pohlodek K，Bozikova S，Meciarova I，et al.Prediction of additional lymph node involvement in breast cancer patients with positive sentinel lymph nodes[J].Neoplasma，2016，63（3）：427-434.

[4]張偉，彭大云，周永梅，等.Leica CM1950 自動恒溫冷凍切片機在冷凍切片中的應用[J].醫療衛生裝備，2017，38（10）：129-131.

[5]傅世祥，劉亮，王志玲，等.冷凍切片制作的質量控制[J].診斷病理學雜志，2018，9（25）：666-668.

[6]連愛瓊.快速冰凍切片技術在病理診斷中的應用分析[J].醫學理論與實踐，2016，29（16）：2251-2252，2267.

[7]劉敏，羅彥麗，唐娟.病理術中冰凍切片特殊組織的制片技巧及應用體會[J].南通大學學報（醫學版），2016，36（3）：225-227.

[8]董蕓蓉.高質量冷凍切片的制作技術探討[J].臨床與實驗病理學雜志，2016，32（3）：349-350.

[9]丁偉，王德田，董建強，等.簡明病理學技術[M].杭州：浙江科學技術出版社，2014：46-51.

收稿日期：2019-4-27;修回日期：2019-5-20

編輯/王朵梅