全腦缺血再灌注誘導大鼠海馬CA1區GluR6巰基亞硝基化的機制

楊紅寧 呂蘭欣 顏曉慶

摘要：目的 ?用大鼠全腦缺血模型探討全腦缺血再灌注誘導大鼠海馬CA1區GluR6巰基亞硝基化的機制。方法 ?將78只雄性SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組）、全腦缺血再灌注組（I/R組）、給藥組（7-NI組、GSNO組、SNP組、NS102組）及溶劑對照組[生理鹽水（Saline）組、DMSO組]，每組6只。采用四動脈結扎去結扎法構建大鼠全腦缺血再灌注模型。運用生物素轉化法檢測蛋白質的巰基亞硝基化，聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡方法對GluR6巰基亞硝基化水平進行分析研究。結果 ?全腦缺血再灌注后，I/R組GluR6巰基亞硝基化水平高于Sham組，差異有統計學意義（P<0.05），7-NI組GluR6巰基亞硝基化水平相比I/R組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），溶劑DMSO組與I/R組相比差異無統計學意義（P>0.05）;GSNO組和SNP組GluR6巰基亞硝基化水平比I/R組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），溶劑Saline組與I/R組相比差異無統計學意義（P>0.05）;NS102預處理組GluR6巰基亞硝基化水平比I/R組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），溶劑DMSO組與I/R組相比差異無統計學意義（P>0.05）。結論 ?7-NI、GSNO、SNP 和NS102都能抑制腦缺血再灌注誘導的GluR6巰基亞硝基化。nNOS介導產生的內源性NO介導全腦缺血再灌注誘導的大鼠海馬CA1區GluR6巰基亞硝基化，并受外源性NO影響;全腦缺血再灌注通過激活KA受體誘導大鼠海馬CA1區GluR6發生巰基亞硝基化。

關鍵詞：谷氨酸受體6亞基;巰基亞硝基化;全腦缺血再灌注

中圖分類號：R364.1+2;Q71 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.18.017

文章編號：1006-1959（2019）18-0051-04

Abstract：Objective ?To investigate the mechanism of GluR6 thiol nitrosylation in rat hippocampal CA1 region induced by global cerebral ischemia-reperfusion in a rat model of global cerebral ischemia.Methods ?78 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group （Sham group）， global cerebral ischemia-reperfusion group （I/R group）， and drug-administered group （7-NI group， GSNO group， SNP group， NS102 group）. And the solvent control group [saline group， DMSO group]， 6 in each group. A rat model of global cerebral ischemia-reperfusion was established by four-arterial ligation and ligation. The biotin-transformation method was used to detect the sulfhydryl nitrosylation of proteins， and the phosphination level of GluR6 thiol was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting.Results ?After global cerebral ischemia-reperfusion， the level of GluR6 thiol nitrosylation in the I/R group was higher than that in the Sham group，the difference was statistically significant （P<0.05）. The level of GluR6 thiol nitrosylation in 7-NI group was significantly lower than that in I/R group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Solvent DMSO group and I/R group There was no significant difference between the two groups （P>0.05）. The nitrosation level of GluR6 in the GSNO group and the SNP group was significantly lower than that in the I/R group，the difference was statistically significant （P<0.05）.There was no significant difference between the Saline group and the I/R group （P>0.05）. The GluR6 sulfhydryl nitrosylation level in the NS102 pretreatment group was significantly lower than that in the I/R group，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference between the solvent DMSO group and the I/R group （P>0.05）.Conclusion ?7-NI， GSNO， SNP and NS102 can inhibit GluR6 sulfhydryl nitrosylation induced by cerebral ischemia-reperfusion. nNOS-mediated endogenous NO mediates GluR6 sulfhydryl nitrosylation in rat hippocampal CA1 region induced by global cerebral ischemia-reperfusion and is affected by exogenous NO; global cerebral ischemia-reperfusion activates KA receptor Induction of thiol nitrosylation of GluR6 in the hippocampal CA1 region of rats.

Key words：Glutamate receptor 6 subunit;Sulfhydryl nitrosylation;Global cerebral ischemia reperfusion

腦缺血/復灌的早期神經元損傷研究中，神經細胞內的神經性一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，nNOS）活性增強，產生大量內源性NO，能夠對神經細胞產生損傷作用[1]，給予外源性NO能發揮對損傷機體的保護作用[2]。有文獻報道在癲癇模型中，KA注射通過激活KA受體誘導蛋白質的亞硝基化[3，4]。本實驗假設腦缺血再灌注誘導GluR6巰基亞硝基化是由nNOS產生的NO參與作用，GluR6巰基亞硝基化與KA受體通道的活化密切相關。本實驗采用注射KA受體抑制劑NS102、nNOS抑制劑7-NI，外源性NO供體GSNO和SNP來探討GluR6巰基亞硝基化受體機制以及外源性NO和內源性NO在全腦缺血再灌注誘導GluR6巰基亞硝基化機制中的作用。

1材料和方法

1.1試劑與器材 ?7-NI、GSNO、NS102購自Sigma公司;SNP購自徐州市中心醫院;GluR6抗體購自Millipore公司，其它試劑為國產分析純。電動勻漿器購自美國Glas-Col公司;全波長酶標儀購自美國Molecular Device公司;蛋白電泳及電轉移裝置購自美國Bio-Rad公司;圖象處理儀購自美國Gene公司;大鼠腦立體定位儀購自美國STOLTING公司。

1.2實驗動物 ?雄性成年SPF級SD大鼠78只，體重250～300 g，由徐州醫科大學實驗動物中心提供SCXK（蘇）2015-0009，通過了徐州醫科大學動物實驗倫理審查，遵照動物福利進行實驗，飼養溫度 20～25℃，濕度40%～70%。實驗中動物自由攝食、飲水，1周換1～2次墊料。SD大鼠按照隨機數字表法分為Sham組、I/R組、給藥組（7-NI組，GSNO組，SNP組，NS102組）和溶劑對照組（DMSO組，Saline組），每組6只。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型及樣品制備 ?采用四動脈結扎法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，使用20%水合氯醛（300～350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，分離雙側頸總動脈，電凝椎動脈。手術第2天動物于清醒狀態下結扎雙側頸總動脈，全腦缺血15 min。Sham組只行顱部手術的皮膚切口，然后縫合。NS102組（20 mmol/10 μl溶于DMSO，于缺血前20 min側腦室注射），GSNO組（GSNO溶于生理鹽水，0.1 mg/kg于缺血前20 min側腦室注射），SNP組（SNP溶解于生理鹽水，5 mg/kg分別于缺血前30 min、缺血后40 min和130 min腹腔注射，即每兩次給藥之間相隔90 min），7-NI組（7-NI溶解于1%DMSO，25 mg/kg于缺血前20 min腹腔注射）。溶劑對照組注射等量溶劑Saline或DMSO。全腦缺血復灌注后，斷頭取腦，分離雙側海馬CA1區，加勻漿緩沖液后勻漿離心取上清液，用BCA微量法測定蛋白濃度。

1.3.2蛋白質巰基亞硝基化測定 ?生物素轉化法（Biotin-Swich method）測定蛋白亞硝基化[5]：用HEN液（250 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.7，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L新亞銅試劑）勻漿，1000 g 4℃離心10 min，取上清;測蛋白并計算濃度，轉為統一濃度0.8 mg/ml，每次取0.8 mg分裝蛋白，用HEN液補充至1 ml;向分裝的蛋白中加10% CHAPS至終濃度為0.4%，再加4倍體積封閉液（9體積HEN液和1體積25% SDS的混合液將MMTS稀釋10倍），置于50℃ 20 min，不斷搖勻;加2倍體積冰丙酮放入-20℃，20 min到30 min后2000 g 4℃離心10 min，棄上清;加HENS液（HEPES：250 mmol/L，pH 7.7，EDTA：1 mmol/L，0.1 mmol/L新亞銅試劑，1% SDS）0.1 ml/mg重懸，轉入EP管中，加生物素（Biotin-HPTP）4 mmol/L，即labeling solution，體積為重懸液的1/3，再加Vc溶液（Ascorbate solution），體積為重懸液的1/5，25℃水浴1 h;加2倍體積冰丙酮放入-20℃ 20 min，2000 g 4℃離心10 min，棄上清;加HENS液，0.1 ml/mg，重懸，加2倍體積中和液（20 mM HEPES-NaOH，pH 7.7，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5% TritonX-100），再加15 μl/mg 亞硝基化瓊脂糖凝珠（Steptavidin-Agarose），冷庫旋轉混勻1 h;每管加0.5～0.6 ml（600 mM NaCl）中和液洗5次，800 g×1 min，4℃離心;用洗脫液（20 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.7，100 mmol/LNaCl，1 mmol/L EDTA和100 mmol/L 2-巰基乙醇）加4倍蛋白上樣緩沖液（sample buffer），混勻煮沸5 min，冷卻待用。

1.3.3免疫印跡 ?等量蛋白樣品經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，以濕轉法電轉移至NC膜上。轉移后的NC膜經3%BSA封閉后加入稀釋好的一抗，4℃過夜，洗膜后加入相應的二抗，37℃反應2 h，洗膜，曝光法顯色，結果以圖像處理儀（Gene Company）分析處理，并以LabWorks軟件分析處理，各條帶的吸光值（OD值）以同一張膜上假手術組的倍數表示。

1.4統計學方法 ?用于分析統計的軟件有Excel，Sigma STAT 32，計量資料以（x±s）表示。分析采用單因素方差分析（ANOVA），多個實驗組與一個對照組比較采用最小顯著差法（LSD），實驗組間比較采用q檢驗（Newman-keuls test），P<0.05為差異有統計學意義。

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收稿日期：2019-7-29;修回日期：2019-8-10

編輯/肖婷婷