淺談L—天冬酰胺酶與其重組表達載體的研究

王遠锏 黃浩勝 陳震宇

【摘 要】來自于細菌和真菌等微生物的L-天冬酰胺酶通過切斷癌細胞L-天冬酰胺的來源實現治療癌癥，本身存在如低毒性、致敏性等問題。使用的重組表達載體將具有無谷氨酰胺酶活性L-天冬酰胺酶提取并生產，擴大L-天冬酰胺酶表達能力并提高其工業化生產潛力。

【關鍵詞】L-天冬酰胺酶；重組表達載體；

1 結構、性質、作用機理

癌細胞無法合成天冬酰胺而從周圍細胞中獲取。L-天冬氨酸酶降解L-天冬酰胺，切斷癌細胞L-天冬酰胺來源抑制癌細胞生長。大腸桿菌中細胞質中表達L-天冬酰胺酶I組成型，具有低速水解L-天冬酰胺（L-Asn）與L-谷氨酰胺（L-Gln）的能力；在缺氧條件下，大腸桿菌周質空腔中積累形成包涵體，具有抗蛋白酶、對宿主毒性小、容易富集純化等優點。L-天冬酰胺酶II為4亞基同聚體，該酶的四聚體形態具有活性，活性中心包括Lys、Cys、His三個氨基酸。細菌來源的L-天冬酰胺酶具有少量的谷氨酰胺酶活性，易產生過敏與超敏反應、血栓及出血等副作用，對肝臟毒害較大。

2 來源與生產

L-天冬酰胺酶在多種微生物體內均有表達，大腸桿菌是天冬酰胺酶藥物最初來源，其L-天冬酰胺酶表達系統研究較為清楚。根據L-天冬酰胺酶II基因表達與ansB啟動子有關[1]，受cAMP受體蛋白正調控與厭氧負調控。當胞內為低水平葡萄糖含量，cAMP含量升高，cAMP-cAMP受體蛋白復合物含量增加并結合ansB啟動子中CAP結合位點，σ70RNA聚合酶與啟動子結合強度提高，基因表達水平上升。除了大腸桿菌之外，真菌也是研究生產L-天冬酰胺酶的對象，Vijay[2]使用土曲霉MTCC1782作為培養對象生產L-天冬酰胺酶，產物產量與安全性都有提高。

3 L-天冬酰胺酶重組表達體系

在L-天冬酰胺酶的生產體系中主要包括大腸桿菌表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統、巴斯德畢赤酵母菌表達系統。低成本，高產量，生產周期短的大腸桿菌表達系統目前較為常用，梁毅偈等[3]完成了大腸桿菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大腸桿菌BL21中的表達，但產物無法正確折疊。枯草芽孢桿菌表達系統蛋白質分泌能力強，分泌蛋白純化難度低。Feng Y等[4]將基因與含p43強啟動子的表達載體pP43NMK重組并導入Bacillus subtilis WB600，在宿主菌中成功實現L-天冬酰胺酶II的重組表達。另外修改組合策略可提高L-天冬酰胺酶在宿主體內的表達水平。巴斯德畢赤酵母表達系統可以對自身表達的蛋白質進行加工，生產的L-天冬酰胺酶更加安全，目前Nagarajan A[5]等人從內生真菌中成功篩選并分離到新型無谷氨酰胺酶L-天冬酰胺酶。酵母表達系統產可以適應高密度發酵，重組體系產品易于純化，是目前一種具有較高應用潛力的的L-天冬酰胺酶表達體系。

參考文獻：

[1] ?ebnem E，Hikmet G.Cloning，isolation and expression of l -asparaginase gene（ansB）in different gram-negative bacteria expressing Vitreoscilla hemoglobin[J].Curr Opin Biotech，2011，22.

[2] Vijay B，Raju K J.Production of L-asparaginase by Aspergillus terreus MTCC 1782 under solid state fermentation using pearl millet and finger millet as mixed substrate[J]J Chem，Biol Phys Sci.2015，5（1）：366-377.

[3] 梁毅偈，孫運軍，胡勝標，等.大腸桿菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大腸桿菌BL21中的表達與抗腫瘤活性[J].微生物學通報，2014，41（4）：607-613.

[4] Feng Y，Liu S，Jiao Y，et al. Enhanced extracellular production of L-asparaginase from Bacillus subtilis 168 by B.Subtilis WB600 through a combined strategy[J]Appl Microbiol Biot.2017，101（4）：1509-1520.

[5]Nagarajan A，Thirunavukkarasu N，Suryanarayanan T S，et al.Screening and isolation of novel glutaminase free L-asparaginase from fungal endophytes[J] Res J Microbiol.2014，9（4）：163-176.

（作者單位：華南師范大學（石牌校區）生命科學學院）