間隔區寡核苷酸分型技術在分枝桿菌 菌種快速鑒定中的價值

朱曉燕 宋華峰 陳慧 吳敏娟 趙妮娜 胥萍

目前抗酸染色(AFS)和分枝桿菌培養仍然是臨床診斷結核病的常用技術[1]。隨著診斷技術的發展，核酸雜交探針、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)和DNA測序等分子技術越來越多的用于菌種鑒定[2-4]。通過核酸擴增可以直接檢測呼吸道標本中的結核分枝桿菌復合物[5]，而不需要通過細菌培養檢測方法，從而使長達2個月的結核病診斷縮短至6 h完成。非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium, NTM)肺病，會表現為咳嗽、疲勞和呼吸短促等癥狀，與結核分枝桿菌感染所致的臨床癥狀相似，但治療方案不同，臨床鑒別診斷困難[6]。因此，有效地鑒定結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌具有重要意義。目前臨床上以IS 6110為基礎的限制性片段長度多態性(IS 6110-RLFP)[7]、多位點可變數目串聯重復序列分析[multiple-locus VNTR(variable-number tandem repeats) analysis，MLVA]、Spoligotyping法等3種技術在分枝桿菌的檢測中應用最廣泛[8-9]。其中Spoligotyping法是一種基于PCR的檢測結核分枝桿菌DNA直接重復區(DR)的基因分型方法，利用Spoligotyping法進行寡核苷酸分型，其結果可分析重復序列是否存在來鑒定分枝桿菌，并與建立的SITVIT2數據庫進行比較。

傳統的Spoligotyping法是采用固相膜雜交技術鑒定間隔子PCR產物，操作上需要進行變性、雜交、酶聯、暗室發光顯影等多個步驟，檢測時間長[3, 10-11]。本研究采用的方法是寡核苷酸探針雜交的結核分支桿菌間隔區寡核苷酸分型方法，有如下改進措施：(1)將單鏈寡核苷酸探針固定在硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane, NC 膜)和尼龍膜上。(2)對DNA模板采用不對稱的引物濃度擴增。(3)直接將單鏈PCR產物在芯片上與反應液進行混合反應，根據反應后的顯色結果判斷結核分枝桿菌的類型。……