新型免疫檢查點HHLA2在人肺腺癌中的表達及其臨床意義

南方圓 陳夢茜 陳洪雷

(1.武漢大學基礎醫學院病理學教研室 武漢 430000；2.武漢市江夏區人民醫院胸外科 武漢 430000)

肺癌是世界上最普遍、最致命的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)被確認為肺癌的主要類型，約占肺癌的85%，肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)是NSCLC最常見的亞型。盡管包括輔助化療和靶向治療在內的多種方法都在加速改進，但LUAD (15%)的5年相對生存率仍然很低[2]。因此，尋求新的治療策略對改善LUAD患者的預后至關重要。

免疫治療是一種刺激免疫系統對癌細胞反應的治療方法，已成為傳統外科手術、放化療和分子靶向治療的重要手段之一。免疫檢查點療法是一種以調控通路為靶點，有效增強抗腫瘤免疫應答的新策略[3]。CD28家族受體與B7家族配體的相互作用在免疫調控和癌癥發病機制中發揮著重要作用。B7家族檢查點目前由10多個成員組成其中包括B7-H7/Human endogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2(HHLA2)[4]，與其他B7家族檢查點不同的是，HHLA2只在人類中被檢測到，而在小鼠中沒有被發現[5]，HHLA2在正常組織中表達較少，而在各種人類惡性腫瘤中廣泛表達[6]。目前， HHLA2的生物學影響和臨床價值尚未完全探討，因此，本研究采用了免疫組化(immunohistochemistry, IHC)方法檢測HHLA2在LUAD及相應的癌旁組織中的表達情況，評價其臨床病理特征的相關性，為免疫檢查點聯合治療提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病人資料

本次研究共涉及肺腺癌組織74例。這些標本來源于武漢大學中南醫院病理科檔案室，從2005年7月至2013年7月被診斷的肺癌患者標本中取得，并有詳細的臨床資料，腫瘤按國際抗癌聯盟(UICC 2010)第7版TNM分級進行細分，臨床病理特征如性別、年齡、吸煙史、生存狀態、腫瘤浸潤深度(T)、淋巴結轉移(N)、遠處轉移(M)，見表1。本實驗符合武漢大學醫學院醫學倫理學委員會的相關規定并獲得批準。

1.1.2組織芯片的構建

本研究共構建了兩個獨立的組織芯片(Tissue microarrays，TMAs)(肺腺癌)。兩名病理專家獨立篩選蘇木精-伊紅染色(HE)的切片，以驗證肺腺癌和結直腸癌的診斷。每個樣本選擇最具代表性的腫瘤和非癌區域直徑為1.5mm的組織，排列后制成肺腺癌的石蠟塊，然后被切成4μm的切片。

1.1.3免疫組化檢測HHLA2蛋白的表達

4μm的組織芯片常規烤片、脫蠟和水化后，進行抗原修復：采用檸檬酸鹽緩沖液微波修復，室溫自然冷卻30min，自來水沖洗，ddH2O清洗3×2min，TBST緩沖液洗滌3×2min；用免疫組化筆畫圈，然后滴加封閉液，室溫濕盒中孵育20min；根據預實驗結果，滴加用抗體稀釋液稀釋后的一抗(HHLA2 1:200，美國Abcam公司)，4°C濕盒孵育過夜；TBST緩沖液洗滌3×2min；滴加DAKO即用型二抗，然后放入37°C濕盒中孵育40min；TBST緩沖液洗滌3×2min；滴加DAB稀釋液(1∶50稀釋，DAKO公司)，顯微鏡觀察顯色情況，反應充分后自來水沖洗終止顯色；蘇木素復染，自來水返藍，脫水，透明和封片，顯微鏡觀察評估并拍照保存。

1.1.4免疫組化染色結果判斷

根據陽性區域(Positive area，AP)和染色強度(Staining intensity，IS)，半定量法分別評價HHLA2在免疫細胞和腫瘤細胞中的表達。陽性區域被分為：0(AP:0%～5%)，1 (AP: 5%～25%)， 2 (AP:26%～50%)， 3 (AP:51%～75%)，4(AP:>75%)。染色強度被定義為：0(陰性)，1(弱)，2(中等)，3(強)。HHLA2表達式計算基于方程：強度分布(intensity distribution，ID)=陽性區域(AP)×染色強度(IS)[2]。因此，高評分的標準為：在腫瘤細胞表達>9，在免疫細胞>1。

1.2統計學分析

用SPSS20.0進行所有數據的分析。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行分析HHLA2的表達與臨床病理參數之間的相關性，以P<0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1在肺腺癌中HHLA2的表達模式

本研究檢測到HHLA2在大多數人肺腺癌中廣泛表達，具有明顯的空間分布規律，HHLA2主要定位于腫瘤細胞和免疫細胞的細胞膜和細胞質中，在腫瘤細胞中尤為明顯。在鄰近的癌旁組織中， HHLA2在肺組織的上皮細胞和基質細胞中均有輕微表達。顯然，HHLA2在腫瘤組織中的免疫組化染色強度顯著高于癌旁組織(P<0.05)。根據診斷閾值，在肺腺癌組織中，HHLA2高表達于77.0%(n=57)的免疫細胞和14.9%(n=11)的腫瘤細胞中。

2.2HHLA2在肺腺癌中表達的臨床病理意義

采用了χ2檢驗研究HHLA2表達與肺腺癌臨床病理特征的關系，在肺腺癌患者中，HHLA2在腫瘤細胞中的表達與臨床病理參數均無關(P>0.05)。

表1 HHLA2表達水平與肺腺癌臨床病理參數的關系

參數nHHLA2Low[n(%)]High[n(%)]P性別男4235(47.3)7(9.5)女3228(37.8)4(5.4)0.866年齡≤645751(68.9)6(8.1)>641712(16.2)5(6.8)0.055浸潤深度(T)T1,T26757(77.0)10(13.5)T3,T476(8.1)1(1.4)1.000淋巴結轉移(N)N04740(54.1)7(9.5)N1,N22723(31.1)4(5.4)1.000TNM階段I,II4336(48.6)7(9.5)III3127(36.5)4(5.4)0.943吸煙史有3125(33.8)6(8.1)無4338(51.4)5(6.8)0.357

3 討論

癌癥是一個可怕的全球醫療負擔，預計2019年全球將有超過1,810萬例新確診癌癥病例和960萬例癌癥相關死亡病例。引人注目的是，肺癌、女性乳腺癌和結直腸癌是極其主要的惡性腫瘤，約占全球發病率和死亡率的1/3[1]。在過去的幾十年里，免疫檢查點療法顯著地改變了癌癥治療領域，就肺癌方面而言，美國FDA已經批準PD-1/PD-L1抑制劑作為一線或二線治療[7]。

隨著免疫檢查點療法被強調為癌癥患者的一種重要治療策略，人們對新增加免疫檢查點的興趣大大增加。作為最近被確定的B7家族檢查點，少數學者針對HHLA2及其在肺腺癌的免疫微環境中的作用進行了研究。據報道，與在癌組織中廣泛表達不同，HHLA2在乳腺、腸道、胎盤、膽囊等正常組織中表達有限[6]。它在人單核細胞中表達，在B細胞中被誘導[8]。有研究已證實HHLA2可能通過與不同配體的相互作用來刺激或抑制T淋巴細胞的功能[6]。HHLA2可以減弱細胞因子的分泌，比如干擾素(interferon，IFN)-γ、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-5和IL-10等[5]。相反，HHLA2也可以通過依賴AKT磷酸化，與其中一個受體跨膜免疫球蛋白結構域2(TMIGD2)結合，共同刺激T細胞的增殖和細胞因子的產生[8]。

本研究評估了HHLA2在肺腺癌中的表達模式和臨床意義，結果表明，HHLA2在肺腺癌中的表達顯著高于非癌性肺組織。值得注意的是，本研究發現HHLA2有不同的表達模式，其在肺腺癌的腫瘤細胞和免疫細胞中均呈陽性染色，而在免疫細胞中尤為明顯，但本研究并未發現HHLA2與肺腺癌臨床病理參數的關系，可能與病例數較少有關。另外，HHLA2被報道了可以通過與不同的配體結合而發揮共抑制和共刺激活性。HHLA2的過表達可導致骨肉瘤和乳腺癌患者生存質量低下[6, 9]。但也有研究表明了HHLA2的共同刺激作用，其中HHLA2可以增強T細胞功能[8]，并對胃癌有良好的預后[10]。本研究認為HHLA2是肺腺癌潛在的免疫治療靶點，可能具有克服抗PD-1/PD-L1免疫治療獲得性耐藥的潛力，進一步的研究需要綜合評價HHLA2的腫瘤異質性和免疫功能，以達到最佳的免疫檢查點治療效果。希望本研究能夠有助于進一步探索針對這些B7家族檢查點的臨床試驗，在設計最佳的聯合免疫治療方法中發揮重要作用。