AMPK調節小鼠耐力變化的機制及結果分析

曾韜

（荊楚理工學院醫學院，湖北 荊門 448000）

0 引言

耐力是長時間進行肌肉工作的運動能力，可以分為無氧耐力、有氧耐力，運動時能量供應存在差異。以長時間有氧代謝為主要供能方式的，是有氧耐力。骨骼肌利用氧的能力，主要與有氧耐力相關。骨骼肌有氧代謝能力上升的表現，是肌纖維氧化酶活性的上升。增加肌肉緩沖能力、能源底物轉運、氧運輸能力，有利于耐力的提升[1]。AMPK在線蟲到哺乳動物的各種真核細胞中廣泛存在，主要形式是異源三聚體。運動中肌肉收縮導致的能量變化，可以由AMPK感受到，并且激活[2]。激活AMPK會對靶代謝蛋白進行磷酸化，將消耗ATP通路關閉，多條代謝途徑分解，對脂肪和糖的代謝進行調控。雖然在骨骼肌能量代謝中，有AMPK參與調控，并且與運動耐力、運動訓練有關，但目前，尚不清楚AMPK對運動耐力調控的作用機制。本次主要探討AMPK調節小鼠耐力變化的機制及結果，現報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

使用雄性C57/BL6小鼠54只，八周齡，小鼠健康，體重（20.3 0.7 ）g。使用主要儀器凝膠成像系統、紫外分光光度計、超低溫冰箱、低溫高速離心機、垂直電泳槽、超純水儀、冰凍切片機等等。主要試劑有丙烯酰胺、蛋白酶抑制劑、亞甲基雙叉丙稀酰胺、磷酸蛋白酶抑制劑、瓊脂糖、AMPKα、ECL增敏化學發光底物試劑等等。

1.2 實驗方法

使用八周齡雄性C57/BL6小鼠54只，進行隨機分成對照組、運動一小時后組和運動耗竭后組（n=18），采用小鼠跑臺實驗（即三組小鼠放入跑臺每天以10 m/min運動15 min，預適應一周）的方式進行前期適應。適應期結束后，對照組的小鼠直接取跖肌、比目魚肌、后肢背側腓腸肌。運動一小時后組和運動耗竭組（判斷小鼠耗竭標準：10s內連續被電擊3次）的小鼠放入跑臺，讓該兩組小鼠以15 m/min的運動速度進行小鼠的耐力實驗，運動一小時后組，在小鼠試驗后，一個小時后取跖肌、比目魚肌、后肢背側腓腸肌。運動耗竭組，在小鼠運動耗竭后，立即取跖肌、比目魚肌、后肢背側腓腸肌。然后分別提取三組小鼠的總蛋白或者RNA。三組小鼠總蛋白或者RNA提取步驟一致。

總蛋白提取步驟：首先配置組織蛋白裂解液，配置方法是采用Tris（體積1 mL，濃度1 mol/L）、EDTA（體積0.4 mL，濃度0.5 mol/L）、NaCl（體積3 mL，濃度3 mol/L）、Brigi（體積8.75 mL，濃度10 %）、NP40（體積1.25 mL，濃度10 %）等試劑加ddH2O100 mL，使用時加入蛋白酶抑制劑；然后取50 -100 mg的肌肉組織加入到1mL的組織裂解液中，用均漿器在冰上充分均漿，裂解30 min；之后通過4℃的溫度和12000 g離心20 min，取上清，獲取總蛋白。

RNA提取步驟：取肌肉組織，加入1 mL的Trizol試劑均漿，20 ℃的室溫下放置20 min，然后加入200 μl的氯仿，使用振蕩法進行混均，在冰上放置3 min，通過4 ℃的溫度和12000 g離心15 min，取上清，加入同體積的異丙醇，混均，室溫下放置15 min，重復離心操作，然后移出上清，加入70 %的乙醇進行洗滌、沉淀，獲取RNA。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件對本次調查的所有數據進行統計分析，其中用%表示計數資料，計數資料的檢驗采用χ2，用（）表示計量的資料，計量資料檢驗采用t值。當P＜0.05，表示兩組數據差異明顯，具有統計學意義。

2 結果

2.1 AMPK激活對運動過程中小鼠腓腸肌內不同肌纖維類型基因表達的影響

小鼠運動后一小時，與對照組相比，快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達下降，數據差異有統計學意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA表達增加59%，數據差異有統計學意義（P＜0.05）。小鼠運動耗竭后，快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達有一定升高，高于對照組，數據差異有統計學意義（P＜0.05），MHC-Ⅱa mRNA表達有一定下降。過渡性肌纖維MHC-Ⅱd mRNA表達持續增加，見表1。

表1 AMPK激活對運動過程中小鼠腓腸肌內MHCs mRNA表達的影響

2.2 AMPK激活對運動過程中小鼠比目魚肌內不同肌纖維類型基因表達的影響

小鼠運動后一小時，相比對照組，比目魚肌內快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達明顯下降，數據差異有統計學意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA表達明顯增加，數據差異有統計學意義（P＜0.05）。小鼠運動耗竭后，快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達出現上升，但仍然低于對照組，數據差異有統計學意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA和MHC-Ⅰ表達逐漸恢復到對照組水平。過渡性肌纖維MHC-Ⅱd mRNA表達，先上升，后下降，見表2。

表2 AMPK激活對運動過程中小鼠比目魚肌內MHCs mRNA 表達的影響

2.3 AMPK激活對運動過程中小鼠跖肌內不同肌纖維類型基因表達的影響

小鼠運動后一小時，相比對照組，跖肌內快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達明顯下降，數據差異有統計學意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA表達明顯增加，數據差異有統計學意義（P＜0.05）。小鼠運動耗竭后，快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達出現上升，數據差異有統計學意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA表達逐漸恢復到對照組水平。過渡性肌纖維MHC-Ⅱd mRNA表達，先下降，后上升，見表3。

表3 AMPK激活對運動過程中小鼠跖肌內MHCs mRNA表達的影響

2.4 AMPK激活對運動過程中小鼠不同纖維類型肌肉中PGC-lα基因表達的影響

從小鼠運動過程中，到小鼠運動耗竭，相比對照組PGC-lαmRNA表達不斷上升。小鼠運動后一小時，在跖肌、比目魚肌、腓腸肌中PGClαmRNA表達，相比對照組明顯增加，數據差異有統計學意義（P＜0.05）。小鼠運動耗竭，在跖肌、比目魚肌、腓腸肌中PGC-lαmRNA表達，相比對照組明顯增加，數據差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 AMPK激活對運動過程中小鼠不同纖維類型肌肉中PGC-lα基因表達的影響

3 討論

肌肉活動時的能量供應代謝特點包括，第一，當運動強度耗能速率，超過有氧產能的最大速率，為滿足代謝需求，要用產能更快的無氧方式，無氧代謝的終產物會對其代謝過程產生限制，無氧功能只是暫時的[3]。第二，隨著運動強度的變化，肌肉活動對能量也有不同的需求。因此需要產能速率匹配耗能的強度。第三，完成所有運動時，必須是連續的能量供應，否則能量供應中斷，會影響肌肉工作[4]。第四，在完成不同強度的運動時，肌肉運動強度、優先啟動的功能系統，與耗能速率和產能的匹配關系有關。第五，有氧供能是最基本的代謝方式，具有完善的調節系統、代謝方式、代謝途徑等。清除無氧代謝的產物，以及恢復能源物質，需要有氧代謝。運動鍛煉會增加線粒體數量，增強功能活動，輔激活因子PGC-lα對線粒體的數量有重要的影響[5-6]。本次研究顯示，PGC-lαmRNA表達，呈現持續上升的趨勢。在運動過程中，AMPK的激活，會使PGC-lα表達增加。AMPK直接將PGC-lα磷酸化，主要是第538位的絲氨酸，以及177位的蘇氨酸。PGC-lα可以增強GLUT-4，以及有關的有氧代謝基因，對自身啟動正反饋調控自身基因轉錄發生作用[7]。PGC-lα和MEF2C能夠對慢肌纖維基因的轉錄發揮共同促進的作用。本次研究中顯示，小鼠運動后一小時，快肌纖維基因表達受到抑制，慢肌纖維相關基因表達上升。小鼠運動耗竭后，慢肌纖維基因表達逐漸恢復到對照組的水平。推斷與運動耗竭的情況下，小鼠體內出現嚴重代謝紊亂有關。同時也反映出，通過長期的適度的耐力訓練，對慢肌纖維表達有促進作用，從而有利于運動耐力的提升。持續激活AMPK，對骨骼肌供能方式有明顯的改善作用，能夠有效增加運動耐力。皮下注射四周小鼠，使用AICAR，和有氧代謝相關的32個基因出現明顯的表達增加，小鼠的運動能力上升[8]。在骨骼肌運動能力中，AMPK發揮著重要的作用。運動時p-AMPKα表達增加，通過加速分解代謝產能，對耗能的合成代謝進行抑制，使運動的骨骼肌能量供應獲得保證，同時運動強度不同，對肌肉也有不同的影響。

綜上所述，激活AMPK，能夠增加PGC-1α mRNA轉錄活性，促進骨骼肌慢肌纖維相關基因轉錄，促進運動耐力的提升。