玳玳果黃酮降脂提取物4個(gè)效應(yīng)組分的含量測定研究

馬國萍，陳 丹，朱仙慕，劉秀棉，洪麗婷，陳 思, 陳 紅

玳玳(CitrusaurantiumL.vardaidaiTanaka)蕓香科柑桔亞屬植物，為酸橙變種，屬藥食同源中藥[1]。玳玳果黃酮降脂提取物是課題組運(yùn)用已獲國家發(fā)明專利授權(quán)的制備工藝制成的總黃酮含量穩(wěn)定>80%且具有良好的降血脂和抗氧化作用的中藥有效部位提取物[2-5]。研究表明，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷等為其體內(nèi)主要效應(yīng)組分[6-7]。為有效控制玳玳果黃酮降脂提取物的質(zhì)量，本研究擬建立HPLC外標(biāo)法同時(shí)測定玳玳果黃酮降脂提取物中4個(gè)主要效應(yīng)組分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷含量的測定方法，為完善并提升玳玳果黃酮降脂提取物的內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試藥 新橙皮苷對照品(批號110722-201109，中國食品藥品檢定研究院)；柚皮苷對照品(批號111857-201101，中國食品藥品檢定研究院)；橙皮內(nèi)酯水合物(純度為98.9%，實(shí)驗(yàn)室自制)、枳屬苷(純度為98.7%，實(shí)驗(yàn)室自制)；玳玳果黃酮提取物(批號20171015，20171114，20171201，自制)；水為超純水；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.1.2儀器 Waters2695高效液相色譜儀；Waters2996檢測器；Empower3色譜工作站；AR2140 萬分之一電子天平，XS205 十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱250-4 Lichrocart C18(4.0 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.2%醋酸水溶液，程序洗脫；檢測波長284 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2供試品溶液的制備 精密稱取玳玳果黃酮降脂提取物約10 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.3對照品溶液的制備 分別精密稱取新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷對照品適量，加甲醇溶解，制得質(zhì)量濃度分別為1.510，1.036，0.275及0.328 mg/mL的對照品溶液。

1.2.4陰性對照品溶液的制備 取缺玳玳果黃酮降脂提取物的空白溶劑，按“1.2.2”項(xiàng)下同法操作即得。

1.2.5專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、陰性對照溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察 精密量取新橙皮苷對照品溶液 100，305，655，1 005，1 500，2 000 μL，柚皮苷對照品溶液100，250，400，800，1 500，2 000 μL，枳屬苷對照品溶液10，30，50，70，100，200，250 μL，橙皮內(nèi)酯水合物對照品溶液40，70，100，200，400，450 μL，依次對應(yīng)，分別放置于2 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度搖勻，即得4個(gè)效應(yīng)組分系列混合對照品溶液。分別精密吸取效應(yīng)組分系列混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，新橙皮苷、柚皮苷、枳屬苷、橙皮內(nèi)酯水合物對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份混合對照品溶液，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各效應(yīng)組分峰面積，分別計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.8重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批(批號20171114)玳玳果黃酮降脂提取物粉末約10 mg，6份，按“1.2.2”“1.2.5”項(xiàng)下同法操作，測定，記錄各效應(yīng)組分峰面積值，計(jì)算含量及RSD。

1.2.9穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h，按“1.2.2”“1.2.5”項(xiàng)下同法操作，測定，分別記錄新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷峰面積，分別計(jì)算RSD。

1.2.10加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的玳玳果黃酮降脂提取物約5 mg(批號20171114)6份，分別精密加入適量對照品溶液(每1 mL含新橙皮苷1.510 mg，柚皮苷1.036 mg，橙皮內(nèi)酯水合物0.275 mg，枳屬苷0.328 mg)，按“1.2.2”“1.2.5”項(xiàng)下同法操作，測定，計(jì)算新橙皮苷、柚皮苷、枳屬苷、橙皮內(nèi)酯水合物的平均回收率及RSD。

1.2.11樣品含量測定 取3批玳玳果黃酮降脂提取物(自制，批號20171015，20171114，20171201)，分別精密稱取提取物粉末約10.0 mg，每批3份，按“1.2.2”“1.2.5”項(xiàng)下同法操作，測定，外標(biāo)法計(jì)算含量。

2 結(jié) 果

2.1專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，注入液相色譜儀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各效應(yīng)組分色譜峰分離良好，陰性對照無干擾(圖1)。

a：混合對照品； B：陰性對照； C：玳玳黃酮提取物. 1：柚皮苷；2：新橙皮苷；3：橙皮內(nèi)酯水合物；4：枳屬苷.

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察 新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷分別在76.365～1 491.482 μg/mL，49.155～1 024.283 μg/mL，5.134～61.151 μg/mL，1.771～40.962 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。4個(gè)效應(yīng)組分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

2.3精密度試驗(yàn) 同一份混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次后測得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物及枳屬苷峰面積的RSD分別為0.48%，0.34%，0.92%及1.09%，表明儀器精密度良好(表3)。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

RSD：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

2.4重復(fù)性試驗(yàn) 同一批號20181114的玳玳果黃酮降脂提取物粉末6份，測得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷平均含量分別為372.7 mg/g(RSD=2.26%，n=6)，294.3 mg/g(RSD=2.44%，n=6)，26.70 mg/g(RSD=2.35%，n=6)，15.00 mg/g(RSD=2.49%，n=6),表明該方法重復(fù)性良好(表4)。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

RSD：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一份供試品溶液分別于0，2，4，6，8，12，24 h測得峰面積，計(jì)算新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物及枳屬苷各效應(yīng)組分RSD分別為0.42%，0.85%，1.95%及1.29%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(表5)。

2.6加樣回收率試驗(yàn) 玳玳果黃酮降脂提取物4個(gè)效應(yīng)組分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷加樣回收率結(jié)果均符合準(zhǔn)確度要求(表6)。

2.7樣品含量測定 3批玳玳果黃酮降脂提取物外標(biāo)法測定計(jì)算得新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷含量(表7)。

表5 穩(wěn)定性考察結(jié)果

RSD：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

RSD：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

表7 樣品含量測定結(jié)果

n=3. RSD：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

3 討 論

玳玳果黃酮降脂提取物是課題組運(yùn)用已獲國家發(fā)明專利授權(quán)的制備工藝制成的總黃酮含量穩(wěn)定大于80%且具有良好的降血脂和抗氧化作用的中藥有效部位提取物，由其制備的提取物具有多組分群和多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)。課題組研究表明，其體內(nèi)主要效應(yīng)組分有新橙皮苷、柚皮苷、枳屬苷、橙皮內(nèi)酯水合物，其中特征活性成分新橙皮苷、柚皮苷占總黃酮含量60%以上。為有效控制玳玳果黃酮降脂提取物的質(zhì)量，針對有效部位提取物具備多組分群的特點(diǎn)，通過建立HPLC外標(biāo)法同時(shí)測定玳玳果黃酮降脂提取物活性成分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷的含量，建立可實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)組分群質(zhì)量控制的定量分析方法。

本研究比較了不同柱溫(20，25，30，35 ℃)及進(jìn)樣量(10，20 μL)對色譜峰分離的影響。結(jié)果表明，柱溫20 ℃時(shí)，各成分色譜峰分離效果較差且未完全出峰；柱溫25 ℃時(shí)，3號色譜峰出現(xiàn)雙峰，分離度受影響；柱溫30℃時(shí)，各成分峰達(dá)到完全分離且峰形良好；柱溫35 ℃時(shí)，成分峰分離良好，但出現(xiàn)色譜峰飄移現(xiàn)象；當(dāng)進(jìn)樣量10 μL時(shí)，各成分峰在22 min內(nèi)出峰，分離良好，基線穩(wěn)定；當(dāng)進(jìn)樣量20 μL時(shí)，會出現(xiàn)前沿峰。故本研究選取柱溫30 ℃、進(jìn)樣量10 μL的進(jìn)樣條件，基線平穩(wěn)，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷色譜峰達(dá)到完全分離。

本研究建立采用HPLC法同時(shí)測定玳玳果黃酮降脂提取物中4個(gè)主要效應(yīng)組分新橙皮苷、柚皮苷、橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷含量的測定方法，經(jīng)方法學(xué)考察，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于玳玳果黃酮降脂提取物多指標(biāo)效應(yīng)組分含量測定的質(zhì)量監(jiān)控。