Cyberknife立體定向放射治療對惡性腫瘤患者外周血MDSCs和Tregs影響

陳遠(yuǎn)貴，徐本華，藍(lán)藝明，張建平，黃妙云，林慶良

近來研究表明，與既往普遍認(rèn)為的放療只具有免疫抑制作用的觀點(diǎn)不同，局部大劑量放療可促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)[1-2]，促進(jìn)腫瘤抗原擴(kuò)增、改變和表達(dá)，釋放招募免疫細(xì)胞的炎癥因子，促進(jìn)腫瘤抗原交叉提呈，誘導(dǎo)腫瘤凋亡受體的表達(dá)，從而激活機(jī)體適應(yīng)性免疫[3]。另一方面，腫瘤通過釋放多種免疫抑制因子以及招募免疫抑制細(xì)胞，導(dǎo)致免疫抑制微環(huán)境阻礙放療產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)[4]。其中髓系抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regular T cells，Tregs)改變腫瘤微環(huán)境，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[5]。如何簡便、有效的監(jiān)測MDSCs和Tregs的變化，為免疫治療和療效評估提供依據(jù)，已成為腫瘤治療的熱點(diǎn)之一。本研究通過動態(tài)監(jiān)測惡性腫瘤患者Cyberknife大劑量分割放射治療后外周MDSCs和Tregs變化，為評價惡性腫瘤患者機(jī)體免疫抑制狀態(tài)和最佳免疫干預(yù)時間點(diǎn)提供數(shù)據(jù)。

1 對象與方法

1.1對象

1.1.1臨床資料 收集2017年9月—2018年1月筆者醫(yī)院放療科Cyberkinfe(射波刀)中心收治的惡性腫瘤患者25位，其中男性20例，女性5例，年齡(59.7±13.7)歲(21～79歲)。原發(fā)性肺癌6例；肺癌腦轉(zhuǎn)移6例；直腸癌腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例；原發(fā)肝癌3例；胰腺癌2例；結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移、直腸癌肝轉(zhuǎn)移、肺癌肝轉(zhuǎn)移和軟組織肉瘤腦轉(zhuǎn)移各1例。所有患者均經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為惡性腫瘤，具有可測量病灶(腫瘤病灶CT掃描長徑≥10 mm)。預(yù)計(jì)生存期≥3月。剔除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的器官功能衰竭或全身疾病，無法耐受放射治療的患者?；颊呓邮芑熎骄倓┝?32.0±7.6)Gy(20～45 Gy)；放療平均單次劑量(7.8±2.1)Gy(7.0～15 Gy)；分割次數(shù)(4.3±1.1)次(2～5次)；腫瘤體積(36.7±32.2)cc(0.5～109.3 cc)；初始最大直徑(39.2±19.2)mm(10～77 mm)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，患者均簽署知情同意書。

1.1.2試劑 所有抗體均購自美國BD公司，包括標(biāo)記MDSC細(xì)胞抗體：APC標(biāo)記的鼠抗人CD33，PE標(biāo)記的鼠抗人CD11b，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人HLA-DR；標(biāo)記Treg細(xì)胞抗體：PerCP-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD4，PE標(biāo)記的鼠抗人CD25，APC標(biāo)記的鼠抗人CD127；IgG同型對照；細(xì)胞裂解液。

1.1.3儀器 流式細(xì)胞儀(FACS VerseTM，美國BD公司)；CT模擬定位系統(tǒng)(Lightspeed,美國GE公司)；Cyberknife立體定向放射外科系統(tǒng)(G4，美國Accuray公司)。

1.2方法

1.2.1放射治療方式 CT模擬定位：真空墊固定患者體位，行CT掃描，層厚1.25 mm；治療計(jì)劃設(shè)計(jì)和審核合格后，利用射波刀實(shí)時追蹤影像系統(tǒng)(脊髓追蹤，肺追蹤，同步追蹤，金標(biāo)追蹤)對腫瘤進(jìn)行精確治療。

1.2.2外周血標(biāo)本采集 用肝素抗凝EDTA管收集清晨空腹外周血5 mL。采集時間點(diǎn)：放療前(Before RT)、放療結(jié)束(After RT)、放療后1周(After 1W)和放療后1月(After 1M)。儲存溫度為4 ℃，并在6 h內(nèi)進(jìn)行染色，染色后1 h內(nèi)進(jìn)行上機(jī)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs 取100 μL EDTA 抗凝外周血，加入 CD11b 單克隆抗體20 μL、CD33單克隆抗體5 μL、HLA-DR 單克隆抗體20 μL，4 ℃避光孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，37 ℃溫箱孵育10 min溶血，離心(3 000 r/min，5 min)棄上清液。繼而加入PBS 2 mL洗滌，再次離心(3 000 r/min，5 min)棄上清液，后加入50 μL PBS重懸上流式細(xì)胞儀檢測。數(shù)據(jù)分析使用FlowJo軟件，最終所獲CD11b+CD33+HLA-DR-/ lowMDSCs 計(jì)數(shù)為相對計(jì)數(shù)，即MDSCs在單核細(xì)胞中所占比率，并觀察比率變化的百分比：

Δ%=TAfter%-TBefore%

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測Tregs 取100 μL EDTA抗凝外周血，加入CD4 單克隆抗體20 μL、CD25單克隆抗體5 μL、CD127 單克隆抗體20 μL，余下步驟同MDSCs的檢測流程。最終所獲CD4+CD25+CD127-/lowTregs計(jì)數(shù)為相對計(jì)數(shù)，即占外周血CD4+細(xì)胞的百分比，并觀察比率變化的百分比：

Δ%=TAfter%-TBefore%

1.2.5臨床療效評估 在CT/MR圖像上測量放療前和放療1月后的腫瘤最大直徑，并計(jì)算其變化值。以實(shí)體瘤治療后評價標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteriain solid tumors, RECIST)評估療效：完全緩解(complete response, CR)：所有目標(biāo)病灶消失；部分緩解(partial response, PR)：病灶長徑總和縮小≥30%；穩(wěn)定(stable disease, SD)：病灶長徑總和有縮小，但未達(dá)PR，或有增加但未達(dá)進(jìn)展(progressive disease, PD)；PD，病灶長徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶。

2 結(jié) 果

2.1外周血中MDSCs和Tregs的變化 MDSCs在單核細(xì)胞中所占比率為：Before RT(4.12±1.22)%，After RT(4.05±1.39)%，After 1W(3.82±0.79)%，After 1M(4.60±1.37)%(圖1)。Tregs在CD4+淋巴細(xì)胞的百分比：Before RT(8.57±3.72)%，After RT(8.27±3.68)%，After 1W(7.97±3.67)%，After 1M(11.16±3.67)%(圖2)。外周血中的MDSCs和Tregs在Cyberknife大分割放療后所占比率減少，1周后最低，1月后急劇增加，高于放療前(圖3，4)。

圖1 流試細(xì)胞術(shù)檢測Cyberknife治療惡性腫瘤患者外周血CD11b+CD33+HLA-DR-/ low MDSCs在單核細(xì)胞中所占比率

圖2 流試細(xì)胞術(shù)檢測Cyberknife治療惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127-/low Tregs占CD4+細(xì)胞的百分比

MDSCs：髓系抑制細(xì)胞；Before RT：放療前；After RT：放療結(jié)束；After 1W：放療后1周；After 1M：放療后1月.

Tregs：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Before RT：放療前；After RT：放療結(jié)束；After 1W：放療后1周；After 1M：放療后1月.

2.2MDSCs和Tregs各自組間配對樣本t檢驗(yàn) Before RT組與After 1M組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MDSCsP=0.046，TregsP=0.005)；After 1W組與After 1M組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MDSCsP=0.011，TregsP=0.024)(表2)。

2.3MDSCs和Tregs相關(guān)性 Before RT與After RT之間變化MDSCs和Tregs呈正相關(guān)(P=0.032)，但MDSCs與Tregs在相對應(yīng)的時間點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

2.4臨床療效 SD患者12例(48%)，PR患者10例(40%)，CR患者1例(4%)，PD患者2例(8%)。Before RT組和Tregs 1M組腫瘤最大直徑分別為(39.12±19.17)和(30.84±19.25)mm；Spearman相關(guān)性分析：兩組腫瘤最大直徑變化與After 1M組的MSDCs水平呈負(fù)相關(guān)(P=0.040)，與其他檢測時間點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

表2Cyberknife治療惡性腫瘤患者外周血MDSCs和Tregs不同時間點(diǎn)的組間比較

Tab 2The comparison of MDSCs and Tregs between groups in peripheral blood monocytes of patients with malignant tumors by Cyberknife at different time points

項(xiàng) 目BeforeRTAfterRTAfter1WAfter1MMDSCsBeforeRTP=0.753(n=16)P=0.262(n=18)P=0.046(n=13)AfterRTP=0.753(n=16)P=0.132(n=17)P=0.111(n=13)After1WP=0.262(n=18)P=0.132(n=13)P=0.011(n=14)After1MP=0.046(n=13)P=0.111(n=13)P=0.011(n=14)TregsBeforeRTP=0.791(n=16)P=0.419(n=18)P=0.005(n=13)AfterRTP=0.791(n=16)P=0.990(n=17)P=0.059(n=13)After1WP=0.419(n=18)P=0.059(n=13)P=0.024(n=14)After1MP=0.005(n=13)P=0.059(n=13)P=0.024(n=14)

MDSCs：髓系抑制細(xì)胞；Tregs：調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞；Before RT：放療前；After RT：放療結(jié)束；After 1W：放療后1周；After 1M：放療后1月.

3 討 論

CyberKnife立體定向放射治療是一種新型影像引導(dǎo)下腫瘤精確放射治療技術(shù)，最適用于惡性腫瘤大劑量分割放療。與傳統(tǒng)的SBRT技術(shù)比較，該法具有實(shí)時影像引導(dǎo)及無框架定位等優(yōu)勢，臨床治療總精度可達(dá)亞毫米級別，被認(rèn)為是目前世界上最為精確的SBRT技術(shù)之一[6-7]。本研究中，患者放療后1月復(fù)查，療效評估：SD患者12例(48%)，PR患者10例(40%)，CR患者1例(4%)。

研究發(fā)現(xiàn)，大劑量分割放療所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與常規(guī)分割劑量照射引起的抗腫瘤免疫完全不同，大劑量分割放療通過導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死，釋放腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量抗原(免疫原性)[8-10]；誘導(dǎo)死亡受體信號通路活化[11]；增加腫瘤MHC-1的表達(dá)[12]；誘導(dǎo)DCs成熟，活化 CD8+CTL細(xì)胞等機(jī)制產(chǎn)生抗腫瘤免疫[13]。另一方面，研究者相繼發(fā)現(xiàn)了多種腫瘤相關(guān)的免疫抑制性細(xì)胞，如Treg細(xì)胞、MDSCs、調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等，這些細(xì)胞與腫瘤的免疫逃逸、免疫耐受、免疫抑制等息息相關(guān)，引起機(jī)體對腫瘤免疫應(yīng)答的抑制[14-15]。因此，研究免疫抑制性細(xì)胞(MDSCs和Tregs)大劑量分割模型治療前后的動態(tài)變化對腫瘤治療的免疫監(jiān)測有重大意義。

MDSCs來源于骨髓祖細(xì)胞和未成熟的髓系細(xì)胞，包括未成熟的粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞。MDSCs 可通過產(chǎn)生精氨酸酶1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、活性氧簇以及消耗胱氨酸和半胱氨酸等途徑抑制T細(xì)胞激活和 T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫[16-17]。Xu等研究表明，前列腺癌15Gy/5f放療后，外周血中MDSCs有所增多[18]。而Crittenden等報道胰腺癌和乳腺癌20Gy/3f放療后，外周血中MDSCs明顯減少[19]；與之相似的直腸癌短療程25Gy/5f研究表明：在長達(dá)60周監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)放療后第5周外周血中MDSCs數(shù)量最少[20]。本研究基于最新進(jìn)的SBRT系統(tǒng)，確保腫瘤放療劑量的精準(zhǔn)。在長達(dá)5周的動態(tài)監(jiān)測過程中，筆者發(fā)現(xiàn)：外周血中的MDSCs在Cyberknife大分割放療后所占比率減少，1周后達(dá)到最低值，但1月后急劇增加，高于放療前。組間配對樣本t檢驗(yàn)：Before RT組與After RT組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Before RT組與After 1M組、After 1W組與After 1M組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，MDSCs作為微環(huán)境中重要的免疫抑制細(xì)胞，其與臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[21]。故筆者認(rèn)為，After 1M的MDSCs在外周血中的數(shù)量與療效呈負(fù)相關(guān)。

Tregs為具有免疫抑制效應(yīng)的若干T細(xì)胞亞群，惡性腫瘤可通過誘導(dǎo)或招募Tregs以逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)對之的監(jiān)視清除。許多研究都證明了在動物腫瘤模型與腫瘤患者外周血以及局部腫瘤組織中Tregs 細(xì)胞顯著升高[22-23]。Sekar等發(fā)現(xiàn)，放化療后凋亡的乳腺癌細(xì)胞能誘導(dǎo)DC分泌IL-27，誘導(dǎo)CD39+CD69+Treg生成，抑制了CTL的細(xì)胞毒性[24]。Tregs對放療具有耐受性，盡管不知Tregs功能是否受到損害，但其數(shù)量在放療后增加[25]。較高的放療劑量有利于促進(jìn) T細(xì)胞的集簇以及腫瘤抗原的表達(dá)，但同時刺激免疫抑制細(xì)胞Tregs的增殖[26]。本研究選擇以CD4+CD25+CD127-/low為檢測免疫表型，檢測無需破膜固定,利于功能研究。與以往研究不同，本研究動態(tài)監(jiān)測了4個時間點(diǎn)Tregs細(xì)胞的變化：放療后Tregs外周血中有所減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1周后達(dá)到最低值，1月達(dá)到最高值，并高于放療前。組間配對樣本t檢驗(yàn)：After 1M組分別與Before RT組(TregsP=0.005)和After 1W組(TregsP=0.024)比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MDSCs能夠通過細(xì)胞因子(IL-10和TGF-β)分泌誘導(dǎo)Tregs的生成和幼稚 T 細(xì)胞向 Treg 的轉(zhuǎn)化，發(fā)揮Treg的免疫抑制作用[27-29]。本研究中，Before RT組與After RT組之間變化MDSCs和Tregs呈正相關(guān)(P=0.032)，表明大分割劑量放療前后MDSCs和Tregs變化趨勢一致，兩者存在相互聯(lián)系。但MDSCs與Tregs相對應(yīng)的時間點(diǎn)計(jì)數(shù)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，可能與樣本量較少有關(guān)，后續(xù)研究中，筆者將加大樣本量進(jìn)一步探索MDSCs與Tregs的相關(guān)性。

本研究中存在的不足：(1)臨床應(yīng)用時間較短，病種不統(tǒng)一，病例數(shù)較少。(2)由于臨床標(biāo)本為腫瘤患者外周血，監(jiān)測的時間較長，部分患者依從性較差。筆者將在后續(xù)的研究中規(guī)范病種、增多病例數(shù)以彌補(bǔ)本研究的不足。