鉤吻素子對大鼠神經(jīng)病理性痛行為學(xué)和脊髓機制研究

金桂林，何賽娣，岳榮彩，許 盈，葉麗香，俞昌喜

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是臨床常見的慢性疼痛，其發(fā)病機制復(fù)雜，治療困難，常伴有睡眠障礙、焦慮、抑郁等神經(jīng)精神疾病，嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量[1]。目前臨床治療NP的常用藥物有抗癲癇藥、抗抑郁藥及阿片類鎮(zhèn)痛藥等，但因其治療作用有限或毒副作用較大而不能讓人滿意，因此新型抗NP藥物亟待研發(fā)。

鉤吻素子為胡蔓藤科植物鉤吻(GelsemiumelegansBenth)中含量較高的一種吲哚類生物堿[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子具有較好的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，且具有高效低毒的特征，具有創(chuàng)制新型鎮(zhèn)痛藥的潛能，但其作用機制尚不清楚[3-5]。本研究選用大鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(spared nerve injury, SNI)所引起的NP模型，進(jìn)一步明確鉤吻素子的抗NP作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 體質(zhì)量為200～250 g的雄性SD大鼠[由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號: SCXK(滬)2009-0005]。實驗操作經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)并遵循國際和本地相關(guān)條例。

1.1.2試劑 鉤吻素子鹽酸鹽(由本課題組從國產(chǎn)鉤吻中分離純化，實驗室批號KM201309，純度99%以上)；加巴噴丁(上海信合化工有限公司)，純度99%；水合氯醛。

1.1.3儀器 機械測痛儀(Dynamic Plantar Aesthesiometer 37450型，意大利UGO Basile公司)；酶標(biāo)儀(Epoch，美國BioTek公司)；免疫印跡成像系統(tǒng)(Carastream公司)；電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠機械痛閾值測定 參照文獻(xiàn)[6]的方法，使用測痛儀測定大鼠的機械痛閾值。待大鼠適應(yīng)環(huán)境30 min后，用刺激絲垂直刺激大鼠后足測痛點。儀器加壓速度為2 g/s，持續(xù)時間25 s，最大刺激強度為50 g。按開始鍵，儀器自動記錄機械刺激力度數(shù)值。兩次測量間隔不少于5 min，每只動物測量3次，取平均值。

1.2.2大鼠SNI誘導(dǎo)NP模型的制備及給藥 大鼠SNI模型的建立方法參照文獻(xiàn)[7]。大鼠腹腔注射10%的水合氯醛，消毒處理后依次暴露，并分離左側(cè)后肢肱二頭肌、坐骨神經(jīng)主干、脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)及腓腸神經(jīng)，絲線結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，并切斷靠近結(jié)扎的遠(yuǎn)側(cè)端。假手術(shù)組僅作暴露神經(jīng)處理。術(shù)后大鼠逐層縫合，注射青霉素預(yù)防感染。模型成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)痛閾合格的動物，于SNI手術(shù)后第3天，術(shù)側(cè)痛閾值低于非術(shù)側(cè)65%，認(rèn)定為SNI模型合格動物；術(shù)側(cè)痛閾值高于非術(shù)側(cè)痛閾值65%的動物不用于該實驗。SNI合格及假手術(shù)大鼠，隨機分為假手術(shù)組、模型組、鉤吻素子低劑量及高劑量組(0.6和3.0 mg/kg)以及加巴噴丁對照組(800 mg/kg)，連續(xù)給藥7 d后，測機械痛閾值。

1.2.3Western-blot法測定膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP) 大鼠測痛結(jié)束后，取L4～L6的脊髓組織置于1 mL勻漿器中勻漿。裂解液裂解后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；加入一抗4 ℃孵育過夜：小鼠抗GAPDH(1∶5 000)、兔抗GFAP(1∶1 000)、兔抗LC3B(1∶1 000)、兔抗Beclin 1(1∶1 000)、兔抗p62(1∶1 000)。棄去一抗，TBST清洗10 min×3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1～2 h：山羊抗小鼠(1∶5 000)、山羊抗兔(1∶5 000)；TBST清洗10 min×3次。用超敏ECL發(fā)光試劑盒顯影，顯影時間為1～5 min。GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J對條帶進(jìn)行吸光度的分析。

2 結(jié) 果

2.1鉤吻素子對SNI大鼠的鎮(zhèn)痛作用 假手術(shù)組術(shù)側(cè)和對側(cè)痛閾值差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.982)；SNI手術(shù)組術(shù)側(cè)痛閾值顯著低于對側(cè)(P<0.01)，且顯著低于假手術(shù)組術(shù)側(cè)(P<0.001)；SNI大鼠和假手術(shù)大鼠對側(cè)痛閾值差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1)。各給藥組大鼠痛閾值變化如圖2所示，SNI模型組大鼠痛閾值顯著低于假手術(shù)組(P<0.001)；與SNI模型組比較，鉤吻素子(3.0 mg/kg)組和加巴噴丁(800 mg/kg)組顯著降低機械痛閾值，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001和P<0.05)，但此兩組對SNI大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)差別卻無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

2.2鉤吻素子對SNI大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用 與假手術(shù)組比較，模型組的GFAP水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，鉤吻素子可顯著降低GFAP水平(P<0.01)。鉤吻素子高、低劑量組對GFAP的影響差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。將各組大鼠最后一次的痛閾值與GFAP水平作相關(guān)性分析，顯示二者呈中度負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.717(P<0.01)。

SNI：分支選擇性損傷. 與假手術(shù)組術(shù)側(cè)比較，##：P<0.01，###：P<0.001；與SNI模型組對側(cè)比較，☆☆：P<0.01；☆☆☆：P<0.001．

SNI：分支選擇性損傷. 與假手術(shù)組比較，###：P<0.001；與SNI模型組比較，☆：P<0.05；☆☆：P<0.01．

2.3鉤吻素子對SNI大鼠脊髓自噬水平的影響 SNI大鼠脊髓LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比正常大鼠高，鉤吻素子可以顯著增加LC3-Ⅱ在脊髓水平。SNI大鼠脊髓Beclin 1蛋白表達(dá)和正常大鼠比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義，鉤吻素子對Beclin 1在脊髓水平的表達(dá)無影響。SNI大鼠脊髓p62蛋白表達(dá)和正常大鼠比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義，低劑量鉤吻素子對p62在脊髓水平的表達(dá)影響較小(P>0.05)，高劑量鉤吻素子對SNI大鼠脊髓水平p62的表達(dá)和正常大鼠比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4～5)。

SNI：分支選擇性損傷；GFAP：膠質(zhì)纖維酸性蛋白. A：各組大鼠脊髓GFAP蛋白表達(dá)水平；B：各組大鼠脊髓GFAP蛋白吸光度值. 與假手術(shù)組比較，#：P<0.01；與SNI模型組比較，☆：P<0.01．

圖4 鉤吻素子對SNI誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛鼠脊髓自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

NP是一種嚴(yán)重影響人類身心健康的疾病，其生理和病理機制極其復(fù)雜，目前尚不完全清楚。近年來，大量證據(jù)提示，膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在NP的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[8-10]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，主要為小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在NP過程中迅速活化，釋放大量致炎細(xì)胞因子和趨化因子等物質(zhì)，并加重神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的活化，造成多種神經(jīng)細(xì)胞形成正反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步加重疼痛[11]。因此，抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少中樞炎癥水平，可顯著抑制NP。

A：LC3； B：Beclin 1； C：p62. 與假手術(shù)組比較，##：P<0.01；與SNI模型組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001.

本研究在SNI誘導(dǎo)的大鼠NP模型上，觀察到灌胃給予的鉤吻素子可呈劑量和時間依賴性地對抗SNI大鼠機械超敏作用，且鉤吻素子3.0 mg/kg組和加巴噴丁800 mg/kg組對SNI大鼠的痛敏改善作用相當(dāng)。本實驗選取加巴噴丁為陽性對照藥，加巴噴丁為抗驚厥藥物，主要作用于神經(jīng)細(xì)胞膜表面鈣離子通道，可減少谷氨酸、去甲腎上腺素及p物質(zhì)等的釋放，可緩解疼痛。但在本實驗中，加巴噴丁對SNI誘導(dǎo)的NP鎮(zhèn)痛作用劑量較大，這也提示鉤吻素子有較好的抗NP作用。在連續(xù)給藥過程中，鉤吻素子無耐受現(xiàn)象，且可能有藥效累加效應(yīng)。相對于阿片類鎮(zhèn)痛藥，鉤吻素子無身體依賴性和精神依賴性，這也是其作為鎮(zhèn)痛藥的一個優(yōu)點[12]。除此之外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子還具有抗焦慮作用[13]，可緩解NP患者的緊張焦慮情緒。這都為鉤吻素子作為抗慢性疼痛新藥開發(fā)提供有利條件。

鑒于較好的鎮(zhèn)痛作用，從鉤吻素子抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化來探討其鎮(zhèn)痛作用機制，發(fā)現(xiàn)鉤吻素子抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與其抗慢性疼痛的作用呈相關(guān)性。因GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，也是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物。因此，本實驗通過Western-blot測定脊髓中的GFAP水平來觀察脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況，同時以大鼠脊髓自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ，Beclin 1及p62表達(dá)水平為指標(biāo)，觀察在SNI疼痛模型中自噬水平的變化以及不同濃度鉤吻素子對SNI大鼠在脊髓水平自噬的影響。小膠質(zhì)細(xì)胞活化主要發(fā)生在NP發(fā)生的初始階段，而星形膠質(zhì)細(xì)胞與慢性疼痛的持續(xù)關(guān)系密切[14]。文獻(xiàn)報道，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制劑氟代檸檬酸可顯著減輕NP[15]，提示抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是治療NP的研究方向。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞數(shù)量最龐大的細(xì)胞，是致炎細(xì)胞因子的主要來源之一。星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活在多種慢性疼痛模型上都被證實，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量增加，GFAP表達(dá)增加[16-17]。通過注射GFAP反義核苷酸妨礙GFAP轉(zhuǎn)錄，或通過注射星形膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制劑都可改善外周神經(jīng)損傷引起的NP[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子可顯著降低SNI大鼠的GFAP水平，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可能是鉤吻素子鎮(zhèn)痛作用的靶細(xì)胞。同時，本研究探索了鉤吻素子對SNI大鼠脊髓的自噬水平。自噬是細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或降解細(xì)胞器實現(xiàn)自我更新的過程，也是細(xì)胞自我保護(hù)機制[19]。研究表明，自噬對NP的發(fā)生、發(fā)展等都有重要作用。在NP過程中脊髓自噬水平顯著降低。反之，通過藥理學(xué)手段促進(jìn)自噬可顯著減輕NP程度，也可延緩NP的發(fā)生[20-21]。本研究通過檢測大鼠脊髓自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ，Beclin 1及p62，發(fā)現(xiàn)SNI大鼠脊髓自噬水平出現(xiàn)抑制，與文獻(xiàn)報道一致[22]。自噬進(jìn)程受阻可導(dǎo)致細(xì)胞底物降解不完全，引起大分子及細(xì)胞器的堆積，進(jìn)而導(dǎo)致NP的加重。而給予鉤吻素子后，脊髓LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62的表達(dá)顯著降低，提示鉤吻素子可以上調(diào)NP脊髓自噬。NP大鼠脊髓自噬可發(fā)生在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞[22]。然而，鉤吻素子發(fā)揮抗NP作用與其促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬及抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，鉤吻素子可顯著緩解SNI誘導(dǎo)的NP，同時上調(diào)SNI大鼠脊髓的自噬水平，抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。該研究為鉤吻素子作為抗慢性疼痛藥物的研發(fā)提供了一定的依據(jù)。