連續離子交換技術高效純化莽草酸

朱明新 李志強 任長洪

(浙江海正藥業股份有限公司，臺州 318000)

莽草酸(Shikimic acid, 圖1)首次由Eykman于1885年從八角科植物的干燥成熟果實中提取得到[1]。

莽草酸能夠通過影響花生四烯酸代謝，起到抑制血小板聚集、動靜脈血栓及腦血栓形成的作用[2]。莽草酸還具有消炎、鎮痛的功能，是許多抗癌藥物的中間體[3-6]。莽草酸還是明星藥物“達菲”即磷酸奧司他韋合成的關鍵中間體[7]。磷酸奧司他韋是目前WHO藥物清單推薦用于重癥流感患者治療的唯一可選擇藥物，長期被公認為是世界上最有效的防治流感的藥物之一，成為各國應對可能暴發的大規模流感的儲備藥品[8-9]。近十年來，隨著流感疫情不斷在全球蔓延，莽草酸的供應壓力持續增大。

圖1 莽草酸結構式

目前莽草酸大多從八角提取獲得，其產量受氣候等自然環境影響較大[10]，再加上提取工藝復雜、純度難于控制、成本高，莽草酸的產量受到嚴重限制。

另外，采用微生物發酵法來生產莽草酸的研究日益增多[11-14]。但目前公開的從發酵液中提取莽草酸的工藝[15-16]都存在一個共同的缺點：樹脂對莽草酸的吸附量特別低，洗脫液純度低，不同批次間的收率和純度波動大等。這導致整個提取工藝生產效率低、成本高，不適合產業化。

本研究采用陰離子交換樹脂預純化步驟，有效去除了莽草酸預處理液中絕大部分強結合力的雜質陰離子，進而顯著提高了陰離子交換樹脂精純步驟的處理量、洗脫收率和純度。巧妙利用了預純化過程中柱流出液pH和電導率變化與流出液組分變化之間的高度對應關系，將連續離子交換技術運用于預純化，實現了預純化過程的連續化、自動化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent公司1260高效液相色譜儀，Dionex公司DX-120離子色譜儀，METTLER TOLEDO公司HA405-DPA-SC-S8在線pH電極，METTLER TOLEDO公司2/4電導率傳感器，上海儀電分析儀器有限公司721N可見分光光度計，臺州市椒江玻璃儀器廠玻璃層析柱(20 mm X 200 mm)，上海華震科技有限公司HZ201陰離子交換樹脂。

莽草酸預處理液由本公司實驗室制得，先由本公司保藏的基因工程菌E.coli HZ09-11發酵制得莽草酸發酵液，發酵液再經酸化、陶瓷膜微濾和納濾濃縮得到莽草酸預處理液。

1.2 分析方法

1.2.1 高效液相色譜(HPLC)檢測條件

色譜柱為Grace Smart TM C18(4.6 mm×250 mm，5μm)柱；以0.1% (m/m) H3PO4: 乙腈= 98 : 2 (V:V)為流動相；流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm，進樣濃度為100～800 mg/L,進樣量為10 μL。莽草酸含量測定采用外標法，所用對照品采購自sigama公司，含量99.8%。

1.2.2 離子色譜檢測條件

色譜柱為IonPac?CS12A(4 mm×250 mm)柱，流動相為3.5 mmol/L Na2CO3和1 mmol/L NaHCO3的混合液，流速為1 mL/min，進樣量為25 μL。

1.3 樹脂的預處理

陰離子交換樹脂采用堿-酸-堿方式再生，最終樹脂轉為OH-型。堿為1 mol/L的NaOH，洗4BV，酸為1 mol/L的HCL，洗4BV，酸洗堿洗之后均采用去離子水洗至pH為6～8。BV是Bed Volume的縮寫，指樹脂柱內裝載樹脂的體積，各種物料量以BV的倍數來表示。

1.4 陰離子交換樹脂單柱預純化

固定好玻璃層析柱(20 mm×200 mm)，濕法裝填50 mL已再生的HZ201陰離子交換樹脂。以莽草酸預處理液為原料，過飽和上柱，上柱流速為1 BV/h，每0.5～2 BV取柱流出液瞬時樣進行檢測，包括HPLC、離子色譜、pH、電導率λ、T430 nm。根據瞬時樣的各參數變化趨勢分析陰離子交換樹脂單柱預純化過程中各組分的分離情況，收集預純化液。λ高低能夠反映料液中處于解離狀態的離子濃度高低；預處理液在波長430 nm可見光處具有較大吸收，因此，采用T430 nm來監測預純化過程中料液色澤的深淺。

1.5 連續離子交換系統進行陰離子交換樹脂預純化

采用的連續離子交換系統是以三根柱為一個單元，每根柱尺寸為20 mm×200 mm，每根裝有50 mL的HZ201陰離子交換樹脂，柱流出液端配備在線pH電極和在線電導率傳感器。系統可根據柱流出液pH、λ的急劇變化自動切換樹脂柱進出口閥門，在不同的陰離子交換樹脂柱上分別循環進行上柱、收集、頂洗和再生的不間斷操作，實現對預純化過程的精準控制，系統如圖2所示。

圖2 連續離子交換系統運行模式圖

操作過程如下：（1）以莽草酸預處理液為原料，從I柱開始連續上柱，當I柱流出液的pH開始急劇下降時開始收集I柱流出液，至流出液的電導率開始急劇上升時停止收集；（2）隨后，將I柱流出液端串聯至II柱進口端，I柱采用0.5 mol/L乙酸水溶液頂洗2BV，從II柱流出。I柱頂洗結束后，斷開I柱和II柱的連接，I柱開始再生，II柱用莽草酸預處理液開始連續上柱，II柱的上柱、收集、頂洗、再生操作與I柱相同，系統按照I-II-III-I的順序循環進行陰離子交換樹脂柱預純化；（3）收集的柱流出液即為陰離子交換樹脂預純化液。再生程序即“水-堿-水”方式再生，先水洗至pH＞5，再采用1 mol/L NaOH淋洗4BV，最后水洗至pH＜8待用。

1.6 陰離子交換樹脂精純

以陰離子交換樹脂預純化液為原料，上柱至裝有50 mL已再生的HZ201陰離子交換樹脂的分離柱，樹脂吸附飽和后水洗2BV，再用1 mol/L乙酸水溶液洗脫5BV，洗脫過程中采用HPLC檢測洗脫液中莽草酸的色譜純度，收集色譜純度≥98%的部分。

2 結果與討論

2.1 莽草酸預處理液成分分析

實驗發現莽草酸預處理液中含有大量結合力強于莽草酸根的雜質陰離子，這些雜質陰離子占據了陰離子交換樹脂大部分的交換基團，導致了陰離子交換樹脂對莽草酸的有效吸附量非常低，并且也降低了莽草酸與結構類似雜質在陰離子交換樹脂上的分離度，導致洗脫液交叉嚴重。

采用1.4的方法過飽和上柱，柱流出液經離子色譜、HPLC檢測，結果如表1所示，柱流出液顏色明顯淺于上柱原料。從實驗結果可以發現預處理液中強結合力的雜質陰離子及其與陰離子交換樹脂結合力強弱順序如下：強解離的負電色素＞SO42-＞PO43-＞Cl-＞3-脫氫莽草酸根(DHS-)＞莽草酸根(SA-)。其中強解離的負電色素、SO42-、PO43-結合力最強，可看作A組分；Cl-略強于DHS-，DHS-略強于SA-，可將Cl-、DHS-看作B組分。

因此去除莽草酸預處理液中A、B組分成為提高陰離子交換樹脂處理量和純化效果的關鍵。

2.2 陰離子交換樹脂單柱預純化

采用1.4的方法過飽和上柱，可以利用預處理液中結合力強的組分置換出結合力弱的組分。預純化去除了預處理液中部分結合力比莽草酸根弱的雜質以及絕大部分結合力比莽草酸根強的A、B組分。以預處理液為原料進行陰離子交換樹脂單柱預純化，原料中莽草酸濃度為7000 μg/mL，色譜純度88%。所得預純化液中莽草酸濃度C、pH和電導率λ隨上柱液體積V的增加而變化的趨勢如圖3所示。

圖中有兩個明顯的拐點，14 BV時流出液pH和T430 nm開始急劇下降、λ值有小幅躍升，莽草酸濃度C開始急劇上升至原料濃度以上，說明此時柱內樹脂上的OH-已經被置換完全，幾乎沒有OH-流出，上柱原料中的A、B組分開始將柱內的SA-置換出來；至86BV時，流出液λ值開始急劇上升，pH逐漸下降，C開始逐漸下降，B組分開始略微穿透，說明此時柱內的莽草酸接近被置換完全，結合力比莽草酸略強的B組分(Cl-、DHS-)開始被置換出來，Cl-被置換出來后生成強解離的HCL，所以流出液pH下降、λ急劇上升。A組分仍結合在樹脂柱上。收集這兩個拐點之間的料液作為陰離子交換樹脂預純化液。

收集的預純化液幾乎不含A組分，僅存在極少量的B組分(Cl-、DHS-)，色譜純度達到97.4%。預純化液中莽草酸濃度為10500 μg/mL，提高到了上柱原料濃度的1.5倍，料液顏色明顯下降，電導率降低至上柱原料的1/3以下。HZ201陰離子交換樹脂預純化處理量達到1L樹脂可處理莽草酸602g。

柱流出液pH、λ曲線的拐點與柱流出液組分變化高度對應，拐點變化趨勢明顯，因此，可以根據在線pH、λ的變化對預純化過程實行精準控制。

2.3 利用連續離子交換技術進行陰離子交換樹脂預純化

采用單根陰離子交換樹脂柱進行預純化，在停止收集后，還有少量的莽草酸結合在樹脂上，并與B組分交叉在一起。為了提高預純化收率、并使預純化樹脂處理量達到最大化，更為了實現陰離子交換樹脂預純化過程的連續化和自動化，按照1.5的方法，采用連續離子交換系統進行陰離子交換樹脂預純化。

表1 HZ201陰離子交換樹脂過飽和上柱流出液中主要陰離子濃度

圖3 HZ201陰離子交換樹脂預純化各參數變化曲線

連續離子交換系統總樹脂體積150 mL，上柱原料體積50L，原料中莽草酸濃度7000 μg/mL。收集得到預純化液27.1L，莽草酸濃度12500 μg/mL，色譜純度96.7%，莽草酸總質量338.8 g，預純化收率96.8%。

整個預純化過程完全實現了連續化、自動化，可以連續不斷地上柱并收集陰離子交換樹脂預純化液。系統可根據柱流出液pH、λ的變化對預純化過程實行精準自動控制，不需要進行HPLC、離子色譜檢測，就能保證所得預純化液的質量穩定均一。預純化過程不需要使用洗脫劑，頂洗液用量少，因此產生的廢水量也很少。

2.4 陰離子交換樹脂精純

陰離子交換樹脂預純化液色譜純度＞96%，色澤淺，但是料液中還含有較多的糖及其它非色譜雜質，需要進一步精純。采用1.6的方法對預純化液進一步精純，當HZ201樹脂接近吸附飽和時，吸附量達到1L樹脂吸附莽草酸100 g，與未經過預純化相比，經過預純化后，精純步驟樹脂處理量可達到原來的10倍以上。精純洗脫液色譜純度達99.4%以上，含量99%以上，3-脫氫莽草酸色譜純度0.5%以下，洗脫收率95%以上。洗脫液的HPLC圖譜如圖4所示。

由于精純洗脫液純度高、色澤淺，不需要進行脫色、結晶等操作，直接濃縮、噴霧干燥可得到高純度莽草酸成品。成品的色譜純度和含量都達到99%以上，提取總收率達到80%以上。

3 結論

圖4 預處理液及精純洗脫液HPLC圖譜

本文開發的連續離子交換技術高效純化莽草酸的工藝，解決了發酵法生產莽草酸的提取工藝瓶頸，所得成品純度高、質量穩定均一，提取收率高；該工藝綠色環保，樹脂總使用量減少了約80%，總廢水產生量也隨之大幅減少；同時該工藝實現了生產的高度自動化和連續化，響應了ICH Q13對連續化生產的大力倡導。采用該工藝能大幅降低發酵法制備莽草酸的生產成本，極具市場競爭力，具有產業化可行性。