探討無菌檢查中和劑β-內(nèi)酰胺酶IV的作用范圍及水解效果

吳揚(yáng) 文靜 王鑫 沈祝飛

(杭州北望生物技術(shù)有限公司，杭州 310015)

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括臨床最常用的青霉素與頭孢菌素，以及新發(fā)展的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等其他非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素。此類抗生素具有殺菌活性強(qiáng)、毒性低、適應(yīng)癥廣及臨床療效好等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)《中國藥典》2015版的要求，β-內(nèi)酰胺類抗生素可選用β-內(nèi)酰胺酶去除其抗菌活性，來排除其對供試品無菌檢查結(jié)果的影響。目前大多廠家用戶對β-內(nèi)酰胺酶的適用范圍尚不清楚，存在混淆使用的現(xiàn)象。本研究選取β-內(nèi)酰胺酶II和β-內(nèi)酰胺酶IV 對常見β-內(nèi)酰胺類抗生素分別進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，為抗生素生產(chǎn)廠家無菌檢查選擇更具專屬性的β-內(nèi)酰胺酶提供參考依據(jù)[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.2 菌種

大腸埃希菌[ATCC(B) 25922](浙江省微生物研究所提供)。

1.1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號1564325)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號1729809)，均來源于OXOID公司。

1.1.4 樣品

抗生素藥敏紙片均來源于杭州微生物試劑有限公司，各藥敏紙片含量見表1。

1.1.5 酶

β-內(nèi)酰胺酶II(批號：7041725D，杭州北望生物技術(shù)有限公司提供，酶活性≥200萬單位/支)；β-內(nèi)酰胺酶IV(批號：6021745D，杭州北望生物技術(shù)有限公司提供，酶活性≥200萬單位/支)。

1.2 方法

1.2.1 供試液制備

取供試品1支(≥200萬單位/支)稀釋至每毫升50萬單位，貯存?zhèn)溆茫A存溫度2～8℃，貯存時(shí)間不超過12 h。

1.2.2 菌液制備

接種大腸埃希菌[ATCC(B) 25922]的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h。

1.2.3 試驗(yàn)組

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)121℃、20 min高壓蒸汽滅菌后，冷卻至45～50℃；分別添加β-內(nèi)酰胺酶II和β-內(nèi)酰胺酶IV至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中，每皿添加活性為50萬單位；再取100 μL大腸埃希菌菌懸液(濃度為106cfu/mL)用涂布棒均勻涂布在平皿中，用無菌鑷子取藥敏紙片平整的貼至平皿上，并做好標(biāo)記，放置在35℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。

1.2.4 空白對照組

方法同試驗(yàn)組，但是胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中不添加β-內(nèi)酰胺酶，空白組藥敏紙片均應(yīng)有抑菌圈。

1.2.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

抑菌圈直徑大于20mm以上為極敏感，15～20mm為高敏感，10～14 mm為中敏感，10mm以下為低敏感，0mm為不敏感。

2 結(jié)果

培養(yǎng)結(jié)束后，量取試驗(yàn)組與空白對照組的抑菌圈3次，根據(jù)抑菌圈的大小差異判斷供試品是否有中和抗生素活性的能力。頭孢類抗生素分解效果對比結(jié)果見表2，培南類及其他抗生素分解效果對比結(jié)果見表3。

表1 常見的β-內(nèi)酰胺類抗生素藥敏紙片及其含量

3 結(jié)論

表2、表3結(jié)果表明，β-內(nèi)酰胺酶II能夠分解大多數(shù)頭孢類抗生素，β-內(nèi)酰胺酶IV作為一種新型的β-內(nèi)酰胺酶，既對頭孢類抗生素有分解效果，還能分解培南類的抗生素，并且對舒巴坦這類β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有較好的抗性。相比之下，β-內(nèi)酰胺酶IV的作用譜范圍更廣泛，作用效果更好。

表2 頭孢類抗生素分解效果對比

表3 培南類及其他抗生素分解效果對比