微量法篩選黃芪提取液聯(lián)合左氧氟沙星體外有效抑菌濃度的研究

常凱，江忠勇，曲遠(yuǎn)青，向禮恩，熊怡淞，王艷艷，鄧菊慧，熊杰,*

（1 中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610083；2 四川省組織修復(fù)材料工程技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，南充 637002）

中藥黃芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bunge, Am]為扶正固本的常用中藥，藥用黃芪為豆科多年生的膜夾黃芪和蒙古黃芪的干燥根，別名綿芪或綿黃芪[1]。味甘性溫，入脾肺二經(jīng)，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、托毒排膿、固表止汗、生肌和利水消腫等功效。黃芪的根中主要成分為黃芪甲苷、黃芪多糖、槲皮素、異鼠李素和氨基酸等。而且富含銅、鋅、鐵、硒等微量元素[2]。臨床常在心血管、免疫、抗癌、抗衰老、血液、肝臟、腎臟等疾病的防治中具有重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪不僅具有保護(hù)心肌，調(diào)節(jié)免疫功能，雙向調(diào)節(jié)血糖和抗衰老等作用，同時(shí)還具有一定的抗腫瘤與抑菌作用[3]。

左氧氟沙星(levofloxacin, LEV)屬于第三代氟喹諾酮類(lèi)藥物，為臨床廣譜抗菌藥中具有重要地位。其作用機(jī)制通過(guò)抑制細(xì)菌DNA解旋酶活性，從而抑制細(xì)菌DNA復(fù)制與合成[4]。對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、衣原體和支原體等均有較強(qiáng)且持久的抗菌作用。由于其抗菌活性強(qiáng)于氧氟沙星，且生物利用度高、組織穿透性強(qiáng)，因而被廣泛應(yīng)用于敏感菌所致的呼吸、泌尿系及皮膚組織感染[5]。隨著左氧氟沙星在臨床中的頻次增加，各種不良反應(yīng)的報(bào)道也日益增多。其主要表現(xiàn)形式有胃腸道反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)和神經(jīng)肌肉病變等[6]。

本實(shí)驗(yàn)室已有研究表明，低劑量黃芪提取液能通過(guò)增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，促使增大細(xì)胞內(nèi)左氧氟沙星的有效濃度，從而提高抑菌效果[7]。為了在降低藥物副作用風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)增強(qiáng)藥物活性，故本研究擬初步篩選出常見(jiàn)致病菌抑菌譜及其最佳抑菌濃度，為強(qiáng)效表皮抗感染藥物的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法：

1.1 藥品與菌株的制備

左氧氟沙星(每片，0.5g)購(gòu)于第一三共制藥(北京)有限公司。黃芪藥材購(gòu)自中國(guó)甘肅省定西市岷縣，經(jīng)西南大學(xué)-西藏農(nóng)牧學(xué)院藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心向禮恩博士鑒定為蒙古黃芪[Astragalus membranaceus(Fish.)Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao]。稱(chēng)取中藥黃芪120.00g，加水1000g，煎煮1h，重復(fù)1次，合并水煎液，濃縮成含生藥1.5g/mL，醇沉，邊加邊搖勻，低溫靜置24h；濾過(guò)，懸蒸回收乙醇，濃縮至生藥2.0g/mL，調(diào)節(jié)pH值至7.5，煮沸濾過(guò)，加入0.125%活性炭，濾過(guò)濃縮至含生藥2.0g/mL，低溫保存，備用[7-8]。

實(shí)驗(yàn)菌株為臨床常見(jiàn)致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌 (ATCC25922)；金黃色葡萄球菌(ATCC29213)；銅綠假單胞菌(ATCC27853)；化膿性鏈球菌(ATCC19615)；鮑曼不動(dòng)桿菌(ATCC19606)；變形桿菌(ATCC33420)；糞腸球菌(ATCC19433)；肺炎克雷伯菌(ATCC700603)；菌株均來(lái)源于美國(guó)微生物菌株保藏中心，保存于西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)胞分子室。

1.2 協(xié)同效應(yīng)評(píng)價(jià)

分別檢測(cè)黃芪提取液?jiǎn)为?dú)和聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)8種臨床常見(jiàn)菌的MIC，以及左氧氟沙星單獨(dú)和聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)8種臨床常見(jiàn)菌的MIC。分別計(jì)算8種常見(jiàn)菌各自的FIC指數(shù)(FIC=A藥聯(lián)合時(shí)的MIC/A藥單獨(dú)時(shí)的MIC+B藥聯(lián)合時(shí)的MIC/B藥單獨(dú)時(shí)的MIC)，F(xiàn)IC指數(shù)＜0.5表明具有協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)IC指數(shù)=0.5～1表面具有相加效應(yīng)[9]。

1.3 微量法抑菌濃度篩選

配置M-H液體培養(yǎng)基，分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、化膿性鏈球菌(M-H培養(yǎng)基加入5%脫纖維羊血)等8種臨床常見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株，分裝于無(wú)菌96孔反應(yīng)板內(nèi)，使菌液濃度均為1.0×105CFU/mL。應(yīng)用倍比稀釋方法配置不同濃度配比的黃芪提取液和左氧氟沙星混合液加入對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔中，終濃度如表1所示，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h(化膿性鏈球菌置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h)后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各反應(yīng)孔OD600吸光度，分析最佳藥物配比濃度[10-11]。

2 結(jié)果

2.1 黃芪提取液與左氧氟沙星的協(xié)同效應(yīng)

表1 各反應(yīng)孔藥物濃度配比分布(左氧氟沙星+黃芪提取液，μg/mL)

分別檢測(cè)黃芪提取液?jiǎn)为?dú)和聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)8種臨床常見(jiàn)菌的MIC，以及左氧氟沙星單獨(dú)和聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)8種臨床常見(jiàn)菌的MIC。分別計(jì)算8種常見(jiàn)菌各自的FIC指數(shù)(FIC=A藥聯(lián)合時(shí)的MIC/A藥單獨(dú)時(shí)的MIC+B藥聯(lián)合時(shí)的MIC/B藥單獨(dú)時(shí)的MIC)。結(jié)果如表2所示，在8種臨床常見(jiàn)菌中，黃芪提取液聯(lián)合左氧氟沙星在體外抑菌試驗(yàn)中均表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)(FIC＜0.5)和相加效應(yīng)(FIC=0.5～1)。

2.2 黃芪提取液與左氧氟沙星的MIC篩選

應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600的吸光度，結(jié)果如圖1所示。每個(gè)菌種熱圖中的橫縱坐標(biāo)分別對(duì)應(yīng)表1坐標(biāo)，即各培養(yǎng)孔藥物濃度與表1一致。檢測(cè)各培養(yǎng)孔在600nm波長(zhǎng)處的吸光值，應(yīng)用軟件設(shè)置6個(gè)吸光值梯度(分別為≤0.08；0.01～0.12；0.12～0.16；0.16～0.20；0.20～0.24；＞0.24)，并生成熱圖。通過(guò)對(duì)熱圖(圖1)的結(jié)果可以看出同濃度的左氧氟沙星在聯(lián)合低濃度的黃芪提取液后抑菌效果有明顯提升。

表2 黃芪提取液聯(lián)合左氧氟沙星體外抑菌FIC統(tǒng)計(jì)表

結(jié)合肉眼判定細(xì)菌增長(zhǎng)水平，大腸埃希菌在20 μg/mL黃芪提取液+0.5 μg/ml左氧氟沙星的濃度時(shí)具有抑制細(xì)菌增長(zhǎng)的能力；金黃色葡萄球菌在320 μg/mL黃芪提取液+0.0625 μg/mL左氧氟沙星的濃度時(shí)具有抑制細(xì)菌增長(zhǎng)的能力；銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度為160 μg/mL黃芪提取液+0.125 μg/mL左氧氟沙星；化膿性鏈球菌的最小抑菌濃度為80 μg/mL黃芪提取液+0.125 μg/mL左氧氟沙星；鮑曼不動(dòng)桿菌的最小抑菌濃度為80μg/mL黃芪提取液+1 μg/mL左氧氟沙星；變形桿菌的最小抑菌濃度為40 μg/mL黃芪提取液+0.25 μg/mL左氧氟沙星；糞腸球菌的最小抑菌濃度為20μg/mL黃芪提取液+0.125 μg/mL左氧氟沙星；肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度為40 μg/mL黃芪提取液+0.125μg/mL左氧氟沙星。

2.3 不同菌株的MIC聯(lián)合分析

圖1 黃芪提取液聯(lián)合左氧氟沙星體外抑菌效力熱圖

對(duì)上述8種菌株的MIC篩選試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析表明，在160 μg/mL黃芪提取液+0.125 μg/mL左氧氟沙星時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、化膿性鏈球菌、變形桿菌、糞腸球菌和肺炎克雷伯菌抑菌效果良好，對(duì)大腸埃希菌和鮑曼不動(dòng)桿菌效果欠佳(如圖2)。

3 討論

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，微量稀釋法能夠經(jīng)濟(jì)、有效、快速地檢測(cè)出病原微生物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)[12]。相比于紙片擴(kuò)散法和瓊脂稀釋法具有更高的時(shí)效性和良好的精密度。為了快速篩選出黃芪提取液聯(lián)合左氧氟沙星的抑菌濃度范圍，本實(shí)驗(yàn)選用寬濃度范圍的二倍稀釋法對(duì)8種病原菌的抑菌濃度進(jìn)行篩選。三次平行試驗(yàn)結(jié)果均一，真實(shí)可信。

圖2 黃芪提取液聯(lián)合左氧氟沙星體外抑菌有效濃度三維分析圖

黃芪的主要成分為黃芪皂苷、黃芪多糖和異黃酮等(如圖3)[13]。其中皂苷類(lèi)物質(zhì)中含量最高的為黃芪甲苷或稱(chēng)為黃芪皂苷Ⅳ[14]。黃芪多糖則由多種單糖組成，其中葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量豐富。而異黃酮類(lèi)的毛蕊異黃酮占有較大比例[15]。黃芪在體內(nèi)和體外研究中均證明其具有一定的抗病毒能力。經(jīng)證實(shí)黃芪甲苷具有抑制乙型肝炎病毒和腺病毒復(fù)制的能力并能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，黃芪對(duì)水皰性口炎病毒、流感病毒、sindbis病毒和柯薩奇病毒等也表現(xiàn)出明顯的抵抗作用，這可能與黃芪自身能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素的能力有關(guān)[16]。然而在臨床應(yīng)用中，黃芪也伴隨著不良反應(yīng)的發(fā)生，如由黃芪注射液所產(chǎn)生的不良反應(yīng)和不良事件較多發(fā)生于40～70歲年齡段的人群，主要集中于全身性發(fā)熱、過(guò)敏性休克、惡心、心肌炎和心功能衰竭等。而左氧氟沙星劑量在每日0.2～0.5g時(shí)不良反應(yīng)約占85%。不良反應(yīng)發(fā)生最早出現(xiàn)在用藥1min后；用藥3d內(nèi)出現(xiàn)不良反應(yīng)占總數(shù)的74. 86%。而不良反應(yīng)主要集中在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)損害、全身性損害、肌肉骨骼肌系統(tǒng)損害、代謝和營(yíng)養(yǎng)障礙及神經(jīng)紊亂等[17-18]。

本研究結(jié)果表明，低濃度的左氧氟沙星聯(lián)合較低濃度的黃芪提取液同樣能夠具有良好的抑菌功效，同時(shí)黃芪自身具有較強(qiáng)的抗病毒和生肌的能力。因而左氧氟沙星聯(lián)合黃芪提取液有望在降低不良反應(yīng)的同時(shí)達(dá)到良好的抑菌目的，為開(kāi)發(fā)新型皮膚抑菌藥物提供理論支持。

圖3 黃芪提取液中的主要成分