抗金黃色葡萄球菌的新策略

武英，周洪彬，李文赟，吳虹麗，吳小林

(抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，四川抗菌素工業研究所，成都大學， 成都 614000)

金黃色葡萄球菌能引起人類廣泛的疾病，如膿皰病，以及危及生命的疾病，包括菌血癥和肺炎[1]。由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的嚴重感染在所有已鑒定的細菌和真菌病原體中具有最高的總病死率(14%)[2]。 金黃色葡萄球菌的致病機理主要是通過分泌多種免疫系統逃避因子實現的。這些因子包括多種細胞毒素(溶血素、溶細胞肽和殺白細胞素)，免疫調節蛋白(超級抗原、超級抗原蛋白和補體抑制蛋白)，蛋白酶和阻止免疫細胞識別和殺滅的因子(蛋白質A、莢膜和過氧化氫酶等)[3-7]。這些分子都以各自不同的方式，使得細菌逃避來自宿主免疫系統的攻擊[3,6,8]。它們不僅能夠協同抑制宿主免疫系統對金黃色葡萄球菌的清除，還阻止針對該病原體的免疫記憶的形成[9-11]。這也是目前金黃色葡萄球菌治療和疫苗策略失敗的主要原因。顯然，我們目前對抗金黃色葡萄球菌等病原體的應對手段存在很大的局限性，因為它已經適應了幾乎所有的免疫識別策略。其中，金黃色葡萄球菌成孔毒素對發病機制的重要貢獻，這些毒力因子作為潛在的治療靶點引起了越來越多的關注。本綜述了金黃色葡萄球菌成孔毒素的致病機理及以其為靶點的治療方法的最新研究進展。

1 金黃色葡萄球菌的致病機理

產生能夠在細胞脂質雙分子層內形成孔的水溶性蛋白質，是幾乎所有生命體中都存在的現象，包括人體細胞，單細胞真核生物和許多細菌。在細菌中，最常見的成孔分子是蛋白質毒素分子，能夠與哺乳動物細胞膜相互作用以促進其裂解，傳送信號分子和調節細胞穩態。

金黃色葡萄球菌毒力的一個關鍵組成部分是一組成孔雙組分毒素的分泌，這些毒素統稱為殺白細胞素(Leucocidins)。這些殺白細胞素包括Panton-Valentine殺白細胞素(LukSF-PV或PVL)，殺白細胞素ED(LukED)，γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)和白細胞素AB(LukAB，也稱為LukGH)[12-13]。這些毒素由兩個獨立的水溶性單體亞單位組成，通過以受體依賴性方式靶向地與宿主白細胞膜結合并形成跨越磷脂雙層的桶狀孔(圖1)，來破壞和殺死白細胞。

雙組分殺白細胞素是由兩個亞單位，受體靶向S型亞基(在色譜柱中遷移慢：LukS-PV，LukE， HlgA， HlgC和LukA)和聚合F型亞基(在色譜柱中遷移快：LukF-PV，LukD，HlgB和LukB)[12]。在大多數宿主細胞上，S亞基識別蛋白質受體(趨化因子受體[LukED和PVL]或整聯蛋白[LukAB / HG])以促進與細胞表面的高親和力結合(1)，然后S亞基識別并募集F亞基(2)，導致宿主細胞表面的二聚化(3)。二聚化之后毒素寡聚體組裝成含有交替排列的S和F亞基的八聚體結構（4）。寡聚化后，在S和F亞基的莖結構域中發生主要的結構變化，導致插入膜并形成跨越宿主細胞脂質雙層的α-桶孔(5)，引起滲透不平衡和細胞裂解[14]。

圖2(A)小鼠吞噬細胞(巨噬細胞和嗜中性粒細胞)和人T細胞系HUT-R5(過表達CCR5的細胞系)暴露于90%致死劑量的LukED(5μg/mL)后，在光學顯微鏡(LM)和熒光顯微鏡下地圖像。可以觀察到特征性膜暈和細胞核的擴張，在以溴化乙錠(EtBr)處理下細胞的滲透性增加，這是孔形成和膜損傷的指標。白色箭頭指向殺白細胞素中毒時特征性的細胞形態變化。(B)電子顯微鏡圖像下，暴露于含有100%致死劑量的LukAB / HG(2.5μg/mL)的金黃色葡萄球菌上清液后，人多形核白細胞(hPMN)細胞系PMN HL60細胞開始裂解[15]。

圖1 殺白細胞素跨膜空通道形成過程

圖2 殺白細胞素介導的免疫細胞裂解

2 殺白細胞素(Leucocidins)的種類

目前臨床感染人類的大多數高毒性金黃色葡萄球菌菌株產生五種細胞毒素：HlgAB，HlgCB，LukAB / HG，Panton-Valentine leucocidin (PVL)，LukED和 LukMF。其中LukMF存在于反芻動物和其他非人類哺乳動物體內分離出的金黃色葡萄球菌譜系中。這些毒性分子的別名、基因位點、靶向免疫細胞、菌種分布、識別受體、毒性機理、物種特異性、亞細胞活性和溶血活性歸納整理見表1[14]。

3 殺白細胞素的晶體結構

我們對這些殺白細胞素在其宿主細胞上形成孔的機制是基于對其晶體結構的測定。1999年，測定了γ-溶血素(HlgB)和PVL(LukF-PV)的F亞基結晶測定，2004年測定了PVL的S亞基和2008年的HlgAB工程化二聚體的晶體結構[16-17]。通過這些晶體學研究，描述了殺白細胞素的主要結構特征(圖3)。發現其S和F亞基非常類似于先前鑒定的α-溶血素的核心結構[18]，包含功能結構域、莖結構域、β-夾層結構域和氨基鎖結構：(1)功能結構域包括邊緣結構域，由識別并結合磷脂和其他分子的高度芳香族殘基組成；(2)富含甘氨酸和疏水的莖結構域，其插入宿主細胞的膜的過程中會發生顯著的結構轉變，形成β-桶狀孔結構；(3)β-夾層結構域，含有亞基間相互作用的關鍵殘基；(4)氨基鎖結構，在殺白細胞素的單體到寡聚體孔結構轉變過程中參與莖結構域定位，該結構在殺白細胞素中可能是不保守的[19]。

圖3(A)γ血溶素(HlgB)的晶體結構圖[20]，結構信息從蛋白質數據庫(PDB，登錄號1LKF)獲得，并且主要結構域通過使用PyMOL軟件著色，分別：藍氨基鎖結構區域、β-夾層結構域、莖結構域、邊緣結構域。(B)HlgAB八聚體的晶體結構[21]，結構信息從PDB(登錄號3B07)獲得，并使用PyMOL軟件對主要結構域進行著色，分別：S亞基(HlgA)、F亞基(HlgB)。圖中還標明了莖結構、邊緣結構、帽結構以及β-桶狀孔結構。

4 對抗金黃色葡萄球菌分泌殺白細胞素的新策略

最新研究發現，一種特異的小分子球狀蛋白Centyrins(～10kDa)，能夠靶向金黃色葡萄球菌分泌的殺白細胞素(Leukocidins)，從而消除細菌破壞宿主細胞的能力，保護人類免疫吞噬細胞免受毒素介導的殺傷，這種新方法可以幫助解決抗生素耐藥性問題。這種蛋白質分子是研究人員從具有結合并中和殺白細胞素能力的中心蛋白質庫中篩選而來[22]。

Centyrins，是一種支架類蛋白質分子[23]，衍生自人肌腱蛋白-C蛋白結合結構域的15個纖連蛋白III型(FN3)的共有序列(圖1A)[3,23]。基于人生腱蛋白-C的共有FN3結合序列的文庫(本文稱為TENCON)在BC環，C鏈，CD環，F鏈和/或FG環位置處呈現氨基酸多樣化性。這種蛋白分子具有高特異性和親和力，并且以非糖基化的單鏈蛋白存在，其缺乏二硫鍵，很容易在大腸埃希菌中大量生產。

為了鑒定能夠特異性結合金黃色葡萄球菌雙組分殺白細胞素的中心蛋白，Rita Chan等進行了一系列體外選擇，涉及親本TENCON蛋白文庫變體[3,24]，鏈和環位置的組合中具有多樣化的殘基。圖4(A)，TENCON(蛋白質數據庫：3TES)的晶體結構。圖中標明了文庫的氨基酸多樣化位點，用于鑒定對白細胞介素具有強親和力的中心蛋白。(B)選擇的殺白細胞素中心蛋白和親本TENCON序列的氨基酸序列比對。環區域的位置加下劃線并標記。所有序列保守的氨基酸殘基以灰色突出顯示。括號中的數字表示氨基酸在中心區中的位置。

最近研究人員使用分子生物學技術對文庫中親本中心進行了更改，創造了一萬億個分子結構略微不同Centyrins。在這個巨大的文庫中，通過從蛋白質-DNA復合物文庫中體外選擇肽(CIS)的方法[4]仔細篩選，發現了209個Centyrins分子，它們恰好能夠與金黃色葡萄球菌分泌的五種主要殺白細胞毒素之一結合。然后通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)和生物層干涉測定(BLI)確認其結合特異性。鑒定每種球狀蛋白分子對金黃色葡萄球菌產生的多種殺白細胞素的靶向特異性(表2)[25]。

5 討論

目前正在臨床開發許多靶向α-毒素的單克隆抗體(mAb)用于預防金黃色葡萄球菌肺炎，包括mAb MEDI4893和KBSA301[26-27]，也發現了許多抗LukAB單克隆抗體[28-29]。盡管目前許多有希望的分子可以治療金黃色葡萄球菌感染，但是這種單靶點方法的失敗有很大的先例[26]。因此，藥物開發者在制定抗金黃色葡萄球菌療法時需要考慮整合多學科聯合策略。本文介紹的小分子球蛋白(Centyrins)通過靶向阻斷金黃色葡萄球菌的裂解白細胞活性來抑制金黃色葡萄球菌的感染性，已經在許多臨床實驗中[3,8,23,30]中進行了探索。這些蛋白分子中某些表現出對殺白細胞素的交叉中和活性，通常，表現出交叉反應特性的蛋白靶向的殺白細胞素在其亞基(例如，HlgCB和LukSF-PV)之間具有明顯的氨基酸序列保守性[14]。

圖3 殺白細胞素晶體結構圖

金黃色葡萄球菌表現出LukAB依賴性細胞外殺傷hPMN。雖然實驗證明可以通過LukAB阻斷性蛋白SM1S17以濃度依賴性方式特異性中和這種細胞毒性。但是如果金黃色葡萄球菌被細胞內化，則SM1S17的hPMN的保護作用大大降低，這些阻斷蛋白分子進入細胞內環境的途徑有限。盡管金黃色葡萄球菌傳統上被認為是細胞外病原體，但越來越清楚的是金黃色葡萄球菌可以在吞噬細胞內存活以促進傳播和發病[31-32]。因此，該方法的一個缺陷是無法從內部中和金黃色葡萄球菌的毒性。因此，臨床應用Centyrins可能需要制定一種機制，使Centyrins能夠進入宿主細胞中。最近證明該策略對于將抗生素與金黃色葡萄球菌抗體結合，從而將抗生素遞送至宿主細胞內是可行的[32]。因此將Centyrins與能夠靶向金黃色葡萄球菌表面的人源單克隆抗體融合，結合成一類新的蛋白質，稱為MABtyrins，它可以更有效地中和金黃色葡萄球菌的毒性分子。這種融合蛋白的工程化為金黃色葡萄球菌感染的治療方法提供了一條潛在的途徑，并且在細胞外和細胞內區都具有活性[26]。

表1 金黃色葡萄球菌產生地殺白細胞素特點

圖4 選定的強效抗殺白細胞素蛋白的晶體結構和序列比對

表2 從文庫中篩選出的能夠特異性結合殺白細胞素的蛋白分子centyrins種類