藥用植物中具有抗真菌活性的內生真菌及其次級代謝產物的研究

武艷霜,陸 悅,朱作斌,陳 瑩,李 穎*

(1徐州醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院， 徐州221004；2徐州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院遺傳學教研室， 徐州221004)

近年來，隨著廣譜抗生素的大量使用，以及器官移植、放化療、血液透析等治療方法的廣泛應用，全球艾滋病人數量的增加，使得臨床免疫缺陷患者的數量急劇增加，真菌感染的發(fā)病率和死亡率逐漸上升，真菌感染已成為臨床重要的感染病癥之一[1]。在眾多的致病真菌中，念珠菌屬(Candidaspecies)是最常引起臨床真菌感染的病原菌，其中白色念珠菌(C. albicans)占比最高[2]。目前雖有大量的抗真菌藥物用于臨床真菌感染的治療，但隨著藥物劑量的提高以及作用時間的延長，真菌耐藥性會迅速出現并逐漸蔓延。耐藥性的出現增加了真菌感染的治療難度和治療費用，同時，抗真菌藥物本身的毒副作用也限制了其臨床應用，因此亟需尋找并開發(fā)高效低毒且不易耐藥的新型的抗真菌藥物[3]。

天然產物是新藥研發(fā)的重要資源。據統(tǒng)計，自1981年至2012年間，美國FDA批準的新藥中，超過一半以上的抗感染藥物(69%)和抗腫瘤藥物(75%)都與天然產物有關。

植物內生菌(endophyte)是指存活于健康植物組織中，卻不會使宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物[4-5]，它是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。內生菌與宿主植物之間長期協同進化，兩者間呈互利共生關系[6]：植物把光合作用產物、水和礦物質提供給內生菌，并給予內生菌以保護；同時內生菌代謝產物能刺激植物生長發(fā)育，參與植物活性成分和次生代謝產物的合成，使宿主對外界環(huán)境的脅迫有很強的抗逆性，因此植物內生菌中更易產生具有生物活性的次級代謝產物。

天然產物雖然是新藥研發(fā)的重要資源，但由于其化學結構的復雜性或特殊性，往往不能通過化學方法直接合成，需要通過提取分離方法獲取，因此，尤其對于植物來源的活性天然產物，存在資源短缺的問題。對植物內生真菌的研究是解決植物資源緊缺問題的重要手段。紫杉醇是一種重要的抗腫瘤藥物，廣泛應用于臨床癌癥的治療。紫杉醇化學結構特殊，不易人工合成，主要依靠從紅豆杉樹皮中直接提取分離。隨著對植物內生菌研究的深入，人們從紅豆杉、紫杉、水松、榛樹等植物中分離得到了多株能夠代謝產生紫杉醇的內生真菌，為紫杉醇的制備提供了一個新的資源[7-9]。

中藥是中華民族的瑰寶，人們可利用植物、動物、礦物等來治療各種疾病，其中，藥物植物是重要的組成部分。近代研究發(fā)現，藥物植物之所以能夠治療疾病，與其中含有的活性成分密不可分。人們在藥用植物中發(fā)現了大量的具有抗真菌活性的天然產物，而這些藥物植物的內生真菌同樣能夠代謝出多種具有抗真菌活性的天然產物。本文對目前已發(fā)現的幾種藥用植物內生真菌次級代謝產物的抗真菌活性的研究進展進行綜述，為從藥用植物內生真菌中尋找先導化合物，開發(fā)新型抗真菌藥物提供參考。

1 黃芩

圖1 黃芩苷分子的化學結構

黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)，別名山茶根、土金茶根，是唇形科黃芩屬多年生草本植物。具有清熱燥熱、瀉火解毒、止血、安胎等功效。研究表明, 黃芩的活性成分黃芩苷(圖1)在抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗感染、抗氧化和治療心血管疾病等方面具有一定的作用，并具有較好的抗真菌活性[10]。李青連等[11]從野生黃芩的組織中分離出97株內生真菌，其中 33 株來自生長期植株, 64 株來自成熟期植株，并將其中95株內生真菌對白色念珠菌等14種指示菌進行抗菌活性實驗。結果發(fā)現：其中91 株內生真菌對一種或多種指示菌具有抑菌活性, 占分離菌株總數的 95.8%，說明其有廣泛的抗菌活性。從成熟期黃芩中分離到的 62 株內生真菌菌株對白色念珠菌有較高的拮抗作用，有拮抗活性的菌株為14株，占總數的22.58%。從成熟期黃芩中分離得到菌株的部位看：葉子中分離出來的內生真菌菌株對白色念珠菌沒有拮抗活性；從莖中分離出來的內生真菌菌株有兩株有抗念珠菌活性，為Arbuscula屬，抑菌圈直徑分別是d ≤ 10 mm、10 mm ＜ d ＜ 15 mm，抑菌效果較好；從根中分離出來的內生真菌菌株有四株有抗念珠菌活性，為Mucor、Alternaria、Trichosporiella、Minimedusa屬，前三個抑菌圈直徑均是10 mm ＜ d ＜ 15 mm，最后一個抑菌圈直徑是d ≤ 10 mm，抑菌效果較好。總的來說，從成熟期黃芩根中分離得到的內生真菌菌株有抗白色念珠菌活性的較多，抗菌活性較好，因此，我們可以重點對這些菌株中的抗菌活性成分進行研究，以擴大藥用資源。

張黎光等[12]采用常規(guī)微生物分離純化方法從表面消毒的黃芩各個組織中分離出17株內生真菌。利用薄層層析分析法和高效液相色譜法從分離出的17株內生真菌中篩選能產生黃芩苷的內生真菌菌株。結果表明：J1及H3兩株內生真菌可以在人工培養(yǎng)基中產生與宿主相同或相似的活性成分黃芩苷。采用形態(tài)學和分子生物學方法對產黃芩苷菌株進行鑒定，可以確定產黃芩苷的內生真菌J1及H3均屬于青霉菌屬。

熊英等[13]研究發(fā)現黃芩苷對白色念珠菌有較好的抗菌活性，其最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度( MFC) 均為1. 0～2. 0 μg/mL。同位素前體摻入試驗發(fā)現，黃芩苷對[3H]-TdR，[3H]-UdR 和[3H]-亮氨酸參入白色念珠菌過程有抑制作用，推測黃芩苷的抑菌作用是通過抑制白色念珠菌的DNA、蛋白質生物合成完成的。

張美玲等[14]研究了黃芩中能有效抗白色念珠菌的活性成分，她們從黃芩中提取了黃芩苷、黃芩苷元，并將黃芩苷與NaOH反應生成黃芩苷鹽。研究將這3種物質對臨床深部真菌感染分離的3株白色念珠菌進行抗菌活性研究，觀察其抑菌圈直徑大小。結果表明：黃芩苷無抗白色念珠菌活性，黃芩苷鹽有一定的抗白色念珠菌活性，而黃芩苷元的抗白色念株菌活性最好。黃芩苷鹽藥粉、黃芩苷元、黃芩苷對 3 株白色念珠菌抑菌環(huán)直徑分別為( 18.7 ± 2.9) mm、( 12.8 ± 1.5) mm、0 mm。張美玲等[15]又進一步從甘肅黃芩中提取黃芩苷，并利用強酸對黃芩苷加熱水解，獲取有效活性成分黃芩苷元，制成黃芩苷元制劑。并對臨床收集分離的假絲酵母菌進行抑菌活性研究，測定黃芩苷元制劑的MIC。結果表明：黃芩苷元制劑對白色念珠菌有最強的抑菌活性，藥物用量為0.50 ～ 0.55 mL，MIC為0.956 μg/mL，其中標準菌株MIC為0.956 μg/mL。可見，黃芩苷的活性成分黃芩苷元抗念珠菌活性極強。而黃芩中分離出來的內生真菌能產生黃芩苷，黃芩苷中能獲取黃芩苷元，所以對黃芩內生真菌的有效利用能擴大藥用資源，為我們提供更多的藥物來源。研究發(fā)現[16-17]一定濃度的黃芩苷對白色念珠菌芽管的形成及粘附性有較強的抑制作用。100 μg/mL 的黃芩苷對芽管抑制作用與兩性霉素 B 的作用相當，而單味藥黃芩對體外白色念珠菌的生物膜也具有明顯的抑制作用。

周智興等[18-19]運用分光光度法檢測黃芩苷對白色念珠菌中琥珀酸脫氫酶 (SDH)、細胞色素C氧化酶 (CCO)、Ca2+-Mg2+-ATPase3種酶活性的影響，并研究了黃芩苷對白色念珠菌細胞周期的影響。研究表明：黃芩苷抗白色念珠菌作用明顯，并可降低白色念珠菌SDH酶 、白色念珠菌 Ca2+-Mg2+-ATPase的活力。生化實驗表明，黃芩苷能使白色念珠菌線粒體SDH酶的活力降低，黃芩苷濃度越高, SDH酶活力越低。

Wu等[20]研究表明，SDH活性發(fā)生變化時線粒體的損傷也同時出現，并與線粒體的升降數目一致, 直接影響氧化磷酸化過程。他們推測：黃芩苷可能通過降低SDH酶的活力來損傷白色念珠菌線粒體, 從而達到抑制白色念珠菌生長的作用。而且黃芩苷可使白色念珠菌處于S /G2 /M 細胞周期的細胞數目下降，提示其生長受到了抑制，從而抑制白色念珠菌增殖，進一步體現抗白色念珠菌活性。

馮鑫等[21]研究了黃芩苷對白色念珠菌凋亡的影響，結果表明：黃芩苷可以通過降低細胞線粒體膜電位MMP和促進細胞內活性氧(ROS)的累積即線粒體途徑而誘導白念珠菌凋亡。

吳秀珍等[22]探討黃芩苷對白色念珠菌超微結構的影響，電鏡下發(fā)現：黃芩苷作用白色念珠菌后細胞壁和細胞膜先發(fā)生變化, 接著出現細胞器和細胞核的損傷，直至細胞出現壞死崩裂性變化。由此推測黃芩苷是通過破壞真菌細胞壁發(fā)揮抗白色念珠菌活性。

2 黃連

黃連(Coptis chinensisFranch.)，又名味連、川連、雞爪連，屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物。有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。小檗堿，又名黃連素，是從黃連等中草藥中提取分離到的一種異喹啉類生物堿物質[23]。其作為療效確切的廣譜抗菌藥物，對多種細菌、真菌、霉菌、病毒等有抑制和殺滅作用[24]。并且有研究表明，其有較好的抗白色念珠菌的功效[25]。厲秀秀[26]從黃連中分離出10株內生真菌，并測得其中4株可以產生小檗堿(圖2)，他們分別是：內生真菌 HL-A，BC，C，D，產量分別為 1.83、0.63 、1.19 、1.28μg/mL。通過形態(tài)學以及分子生物學方法將 HL-A，BC，D 確定為擬星衣屬(Arthopyreniaceae)，擬莖點霉屬(Phomopsis)和擬隱孢殼屬(Cryptosporiopsis)，而HL-C尚不能確定。

向建輝[27]從黃連中分離出15株內生真菌，并采用色譜法對菌株 HL-Y-3 的菌絲進行檢測，發(fā)現其能產生小檗堿，同時利用核磁共振分析和質譜分析驗證菌絲中的小檗堿與鹽酸小檗堿對照品的結構一致，其含量9.313 μg/g(小檗堿/菌絲干重)。

張峰華等[28]對產小檗堿的黃連內生真菌HL-Y-3菌株做了深入的研究，發(fā)現HL-BC菌株比HL-Y-3菌株產小檗堿產率低，產量分別為0. 664μg/mL、9.313μg/g。因此可以重點培養(yǎng)和研究HL-Y-3菌株，以擴大小檗堿來源，最終擴大抗白色念珠菌制劑的來源。

圖2 小檗堿分子的化學結構

Freile 等[29]的研究發(fā)現，小檗堿在體外對多種分離于人體的白色念珠菌有較好的抑制作用。姜遠英等[30]研究表明小檗堿與氟康唑在體外聯用有很好的協同抗氟康唑耐藥的白念珠菌作用。孔德道等[31]研究表明小檗堿與克霉唑在體外聯用有很好的協同抗氟康唑耐藥的白念珠菌作用。傅子晉[32]的研究表明，小檗堿與咪康唑體外聯用能夠協同對抗耐藥白色念珠菌。并推測二者聯合作用時，小檗堿通過增加真菌細胞不可逆轉的慢性損傷，從而體現其持久穩(wěn)定的對真菌細胞的殺傷作用。

Xu等[33]認為小檗堿協同氟康唑對抗耐藥白色念珠菌的機制是升高白色念珠菌胞內的活性氧以及加強了線粒體有氧呼吸作用，從而抑制白色念珠菌，達到更好的抗菌效果。吳玲等[34]研究表明耐唑類藥物白色念珠菌能過度表達耐藥基因 CDR1，CDR1 通過轉錄因子 Tac1p 結合到啟動子的順式藥物反應元件(DRE)上進行性轉錄激活而使白色念珠菌耐藥。小檗堿協同氟康唑抗耐藥白色念珠菌的機制是，二者聯合應用時，小檗堿能夠抑制Cdr1p的運輸功能和CDR1mRNA上調，干擾蛋白-DRE 轉錄激活復合物，并結合到 CDR1 的 DRE 上。從而阻止耐唑類藥物白色念珠菌過度表達基因CDR1而耐藥。梁蓉梅等[35]研究小檗堿作用于白色念珠菌的靶位是劑量依賴性非競爭抑制24-甲基轉移酶(24-M ST)，小檗堿對此酶的抑制作用顯著，在真菌合成麥角甾醇的過程中，小檗堿阻止了真菌對合成麥角甾醇的必需物質L-甲基-蛋氨酸的利用，最終導致24-二烯-3β醇、麥角甾烷-8的堆積和麥角甾醇的缺乏，從而抑制白色念珠菌增殖。

3 銀杏

銀杏(Ginkgo bilobaL.)，為銀杏科、銀杏屬落葉喬木，具有活化石之稱。具有抑菌殺菌、清熱解毒等功效，是珍貴的藥用資源。其組織內含有豐富的內生菌，研究人員從中分離出500余株內生真菌，郭建新等[36]采用菌絲生長抑制法測定了分離出來的內生真菌對7種植物病原真菌的抑制作用。結果表明302株具有抗菌活性，所占比例較高。因此，銀杏內生真菌是一個潛在而又豐富的抗菌新藥資源庫。

于洪升等[37]采用微量稀釋法測試銀杏內生真菌粗提物抗病原真菌活性，結果發(fā)現共計5株內生真菌粗提物的抗白色念珠菌活性較為顯著，分別為：T-1, T-16,T-33, T-35,T-1-2-1, T-3-8-1，主要屬于擬莖點霉屬，毛殼屬，曲霉屬及青霉屬內生真菌。而青霉屬的T-1-2-1內生真菌抗白色念珠菌活性最為顯著，MIC80為8 μg/mL。李虎強等[38]從浙江天目山分離出56株銀杏內生真菌，發(fā)現其中有9株內生真菌的粗提物有較好的抗白色念珠菌活性，他們同樣發(fā)現編號為T-1-2-1青霉屬的內生真菌粗提物抗菌效果最好。因此，我們可以重點對T-1-2-1菌株的內生真菌粗提物成分進行研究，以期待能夠找到有效的抗白色念珠菌的天然產物。

李涵等[39]對銀杏內生真菌進行抗菌活性篩選，發(fā)現其內生真菌菌株L43的抗菌譜最廣，對白色酵母菌有較強的抗菌效果，最小抑菌濃度 ≤ 12.5%，其發(fā)酵液萃取組分的抗白假絲酵母菌活性檢測結果是無水乙醇、乙酸乙酯及二氯甲烷萃取粗提取具有抗菌活性，其 MIC 分別為1mg/mL、1mg/mL及0.25mg/mL。其中二氯甲烷組分的抗菌活性最高。因此，重點對二氯甲烷萃取粗提物組分進行研究，有利于發(fā)現抗白色念珠菌的天然產物，擴大藥用資源。

4 虎杖

虎杖(Reynoutria japonicaHoutt.)，具有利濕退黃，清熱解毒，散瘀止痛，止咳化痰的功效。用于濕熱黃疸，淋濁，帶下，風濕痹痛等。曾松榮等[40]從虎杖中分離出3株具有抑制白色念珠菌作用的內生真菌，它們分別屬于無孢菌類、青霉屬和曲霉屬。這3株內生真菌的抗白色念珠菌實驗結果：抑菌圈直徑大小分別為9、12、19 mm，其中曲霉屬的內生真菌抑菌效果最好。張渝華等[41]在虎杖根中提取出白藜蘆醇(圖3)，并測得其對白色念珠菌有一定的抑菌作用。劉蕓等[42]從虎杖中分離得到的15株內生真菌中有5株能產生白藜蘆醇，產量最高菌株可產生1.528 μg/mL的白藜蘆醇。董倩[43]從虎杖中篩選出12株能產白藜蘆醇的內生真菌，最高產量可達1.440 mg/mL。彭浩[44]從虎杖中提取了116株內生真菌，發(fā)現其中有兩株內生真菌產白藜蘆醇(苷)，其中一株白藜蘆醇的產量為4.812 mg/mL。這說明虎杖內生真菌可以產生與虎杖活性成分相同生物活性物質。 張瑞[45]研究出白藜蘆醇能抑制白色酵母菌可能是通過改變真菌細胞自身作用和與生物膜黏附的表面之間的疏水性、化學鍵等，來改變二者配體和受體的特異性結合，最終導致真菌生物膜細胞的脫落；或是白藜蘆醇直接作用于白色酵母菌生物膜分泌的甘露糖蛋白，改變細胞的疏水性，使細胞之間不能粘附；或是藥物滲入生物膜后吸附于白色酵母菌細胞壁上，干擾其合成，使細胞壁破損并進入細胞內部，抑制細胞的生長繁殖，導致真菌死亡。

圖3 白藜蘆醇分子的化學結構

5 雷公藤

雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook. f.)為衛(wèi)矛科雷公藤屬，又名黃藤、斷腸草，有清熱解毒、消腫止痛、祛風除濕等功效。內生真菌在雷公藤中普遍存在，宋萍等[46]利用組織塊法對雷公藤植物內生真菌進行了分離，獲得了22株形態(tài)型不同的內生真菌。他們發(fā)現雷公藤內生真菌的菌絲體和發(fā)酵液的提取物有較好的抗白色念珠菌活性。其中菌株1#、3#、6#、7#、13#、14#、17#、18#、21#、23#、24#的菌絲體提取物有抗白色念珠菌活性。菌株1#、5#、6#、7#、8#、13#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、21#、24#的發(fā)酵液提取物有抗白色念珠菌活性。總的來說，雷公藤內生真菌普遍有抗白色念珠菌活性。

Li等[47]從雷公藤中篩選獲得了一株對白假絲酵母菌有一定的抑制作用的內生真菌，其能代謝產生一種與肺炎球菌素和棘白霉素化學性質相似的新型的環(huán)肽類化合物(圖4)，并證明這個新型的環(huán)肽類抗生素是對抗白假絲酵母菌的活性成分。

6 越南槐

越南槐(Sophora tonkinensis Gagnep.)是豆科，槐屬灌木，具有清熱解毒，消炎止痛之效。 姚裕群等[48]對238株越南槐內生真菌進行抗白色念珠菌活性篩選，結果顯示，3株內生真菌有抑菌圈產生，其中內生真菌GRPH-0活菌塊對白色念珠菌的抑菌圈直徑最大，且對其他念珠菌屬具有不同程度的抑制作用。

7 展望

圖4 環(huán)肽類化合物的化學結構

藥用植物內寄生有豐富的內生真菌，且這些內生菌的次生代謝產物活性與植物本身有一定的相似性，雖然兩者的具體關系、次生代謝產物的合成機制等方面還需要更加深入的研究，但可以推測，藥用植物起功效的成分不一定都是植物本身，也有可能是其內生菌的次生代謝產物。同種菌在不同的宿主植物中，或是在相同的宿主植物中但改變其培養(yǎng)條件，其次生代謝產物便具有化學多樣性。次生代謝產物是天然產物的重要來源，這使得藥用活性物質的來源變得更為廣泛[49-51]。據資料統(tǒng)計，新的生物活性物質中51%是內生菌的新品種[52]。因此，相關研究將有利于我國藥物的開發(fā)和藥用植物資源的保護與利用，也有利于利用植物內生菌篩選結構新穎且活性顯著的抗菌活性物質。并且，大部分內生真菌均可在人工培養(yǎng)條件下相對快速大量繁殖，通過基因改造等方法，可使特定成分在改造菌株中高產出，為某些活性藥物成分如紫杉醇的獲取提供新的資源。

然而，目前對內生菌資源利用較少，內生菌的相關研究仍然處于早期水平，植物類群的研究不過數百種，僅涉及了數量龐大的內生菌種類中的很小一部分。內生菌的次生代謝產物雖然種類多，但復雜多樣又不穩(wěn)定，所以相關研究也應該關注這一方面。內生菌暫時無法大規(guī)模推廣也是開發(fā)內生真菌資源的瓶頸。