植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌抑菌活性的研究

張含薇,謝遠紅,金君華,張紅星

(北京農學院食品科學與工程學院/食品質量與安全北京實驗室/農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京102206)

乳酸菌是存在人和動物消化道中的益生菌，生長代謝過程中會產生乳酸、過氧化氫和細菌素等抑菌物質[1-2]。其中，細菌素是一類具有抑菌活性的蛋白質、多肽或前體多肽[3-4]，它具有穩定、無毒、不改變食品本身的風味等特點，同時它可被機體消化道中一些蛋白酶降解，不會在體內堆積引起副作用[5]。根據化學結構，分子質量大小和穩定性將細菌素分為四類[6]：羊毛硫抗生素，分子量5 kD，含19～50個以上氨基酸分子[7]；小分子的熱穩定肽，其結構特征為N-末端信號肽序列長度為18～21個氨基酸，分為IIa、IIb、IIc類[7]；熱敏感的大分子蛋白，相對分子質量一般大于10 kD[7]；復合型乳酸菌細菌素[7]。

其中IIa類乳酸菌細菌素是研究比較廣泛及深入的一類乳酸菌細菌素[8]。它們是一類具有抑制革蘭氏陽性單核增生李斯特菌活性、熱穩定性未經修飾的小肽[8]。Jack RW等[9]在火腿中發現添加細菌素后單核增生李斯特菌的活菌數降低。岳喜慶等[10]發現BC-3細菌素可以抑制單核增生李斯特菌。馬淑霞等[11]利用瓊脂擴散法檢測到片球菌素PA-1對單核增生李斯特菌有抑菌活性。現有的研究表明，大部分的IIa類乳酸菌細菌素具有對單核增生李斯特菌有抑菌活性，但對革蘭氏陰性細菌的抑制作用研究較少。

前期研究中，課題組從傳統發酵的肉制品中分離、鑒定得到1株植物乳桿菌BM-1的菌株。研究表明，植物乳桿菌BM-1能夠代謝產生1種新型的IIa類乳酸菌細菌素BM-1，對部分革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌具有明顯的抑菌活性，包括單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌等[12]。在此基礎上，本試驗研究細胞和分子水平上植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的作用。采用管碟法檢測植物乳桿菌素BM-1對不同大腸桿菌的抑菌活性，并篩選出5株大腸桿菌通過生長曲線、活菌數、生物膜形成和實時熒光定量PCR的方法，多角度探究植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC54003，大腸桿菌(Escherichiacoli)CGMCC1.2527，大腸桿菌(E.coli)CGMCC1.0506，大腸桿菌(E.coli)CGMCC1.2222，大腸桿菌(E.coli)CGMCC0.2154，大腸桿菌(E.coli)CGMCC1.2389，大腸桿菌(E.coli)CGMCC1.2168，大腸桿菌(E.coli)CGMCC1.8423，大腸桿菌(E.coli)CICC8099，大腸桿菌(E.coli)CMCC44102，大腸桿菌(E.coli)CMCC44103，大腸桿菌(E.coli)ATCC25922，大腸桿菌(E.coli)ATCC8739，植物乳桿菌BM-1(Lactobacillusplantarum)均來自實驗室保存。

MRS肉湯，MRS瓊脂培養基，LB培養基[13]，制備培養基使用的試劑均為國產分析純級；硫酸銨，購于國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂(Agar)，購于北京奧博星生物技術有限公司；3500Da透析袋，購于北京瑞達恒輝科技發展有限公司；PrimeScriptTM1st cDNA Synthesis Kit，購于TAKARA公司；結晶紫，購于北京陸橋技術有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII，購于TAKARA公司。

1.2 試驗儀器

DL-CJ-1NDII超凈臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；LHS-100CH恒溫恒濕箱，上海一恒科技有限公司；DYY-6DCP-32B型恒流電泳儀，北京六一儀器廠；GL-21M-臺式冷凍離心機，上海滬湘儀離心機儀器有限公司；WBS-100微生物比濁法測定儀，北京先驅威鋒技術開發公司。

1.3 試驗設備

BT2202S電子天平，德國Starorius集團；FD-1A-80真空冷凍干燥機，德國CHRIST公司；Biologic LP陽離子交換系統，美國伯樂公司；酶標測試儀，美國Bio Rad公司；StepOnePlus Real-Time PCR System，美國ABI公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 植物乳桿菌素BM-1的制備 取-80 ℃冷凍保藏的植物乳桿菌BM-1的菌株，以2%接種量接種于MRS肉湯中，37 ℃恒溫培養12 h后，以相同接種量至1 L MRS肉湯中進行擴大培養，37 ℃恒溫培養20 h，9 000 r/min，離心15 min，發酵上清液中加入硫酸銨，至終飽和度為75%(如1 L上清液加516 g硫酸銨)，4 ℃沉淀12 h，9 000 r/min離心15 min，100 mL去離子水溶解沉淀形成粗提溶液。粗提溶液透析過夜，利用陽離子交換層析得到植物乳桿菌素BM-1溶液，真空冷凍干燥48 h，得到純化的植物乳桿菌素BM-1粉末，采用牛津杯法測定植物乳桿菌素BM-1的效價[14]。

1.4.2 大腸桿菌的菌懸液制備 以2%的接種量接種于5 mL LB培養基中，37 ℃振蕩培養12 h。用0.85%的生理鹽水梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，充分混勻。吸取1 mL于平板底部，倒入LB固體培養基15～20 mL左右，混勻，放在37 ℃的培養箱中培養18～24 h，進行菌落計數，找出合適的梯度，使菌懸液達到1×102和1×107CFU/mL，保存備用。

1.4.3 植物乳桿菌素BM-1抑制大腸桿菌活性的測定 以12株大腸桿菌為指示菌株，采用管碟法做抑菌試驗[15]。吸取100 μL大腸桿菌(約1×107CFU/mL)于平皿底部，傾注LB固體培養基15～20 mL左右，充分混勻，靜置凝固。在每個平皿中等距離放置牛津杯4個，每個牛津杯中加入100 μL純化的植物乳桿菌素BM-1(效價512 Au/mL)及無菌水作為空白對照，37 ℃恒溫培養8～10 h，測量抑菌圈直徑，每個菌株做3個平行試驗。

1.4.4 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌生長和活菌數的測定 取生長至對數期的大腸桿菌菌液，將菌液稀釋成含活菌數為1×102CFU/mL的菌懸液，取200 μL菌懸液加入到10 mL含植物乳桿菌素BM-1(效價512 Au/mL)的LB液體培養基中，并置于37 ℃，分別用OD540nm微生物比濁儀，每隔30 min測定，共測24 h；活菌計數，每隔4 h取樣，共測24 h；以未加植物乳桿菌素BM-1的菌懸液為對照組，繪制出植物乳桿菌素BM-1作用下大腸桿菌的生長曲線和活菌數曲線[16]。

1.4.5 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌生物膜形成的測定 取生長至對數期的大腸桿菌菌液，將菌液稀釋成含活菌數為1×102CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌懸液加入到100 μL含植物乳桿菌素BM-1(效價512 Au/mL)LB液體培養基中，同時設以未加植物乳桿菌素BM-1的菌懸液為對照組，以LB液體培養基為空白對照。將96孔板在37 ℃條件下恒溫培養24 h，用PBS沖洗3次除去浮游菌體，充分干燥后每孔加入100 μL 1 %結晶紫染料，染色10 min，傾倒染液并以無菌水沖洗3次，吹干；加200 μL的95%乙醇，復溶30 min；酶標儀590 nm測定吸光值；每組做3次平行試驗[17]。

1.4.6 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌甘露糖磷酸轉移酶基因表達的測定 采用玻璃珠-酚仿法提取RNA。根據吳思琪[18]等的方法進行總核酸的提取，消化DNA，最后用PrimeScriptTM1st cDNA Synthesis Kit合成cDNA。

實時熒光定量PCR體系10 μL 2×SYBR Premix ExTaqII，上下游引物各1 μL，0.4 μL ROX染料，4.5 μL ddH2O，1 μL cDNA模板，反應總體積為20 μL。所有待測樣品均設3個重復，并用去離子水代替模板做陰性對照。PCR反應體系：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。所用引物manYF(5′-CCAACCCAACAGATGTAGAGCG-3′)，manYR(5′-TGACGGAATGCCATACCACC-3′)；manZF(5′-ACCAGACGGGCAAAGAACAC-3′)，manZR(5′-CGCAGTAGCCACATACAAGCAA-3′)；27F(5′-CGTATTCACCGTGGCATTCTG-3′)，149R(5′-GAGCAAGCGGACCTCATAAA-3′)。

1.4.7 數據處理與分析 本研究采用Spss 18.0軟件對試驗結果進行統計分析，組間數據比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)以P<0.05表示顯著差異。

2 結 果

2.1 植物乳桿菌素BM-1抑制大腸桿菌活性的測定

采用牛津杯抑菌法測定植物乳桿菌素BM-1對12株大腸桿菌的抑菌效果見圖1。與牛津杯內徑6.00 mm相比，植物乳桿菌素BM-1對12株大腸桿菌均有不同程度的抑制作用。為進一步探究植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的作用方式，選取5株不同敏感型大腸桿菌，分別是1株具有明顯抑菌活性的大腸桿菌CGMCC1.8723(抑菌圈直徑為15.00 mm)，3株對植物乳桿菌素BM-1敏感性稍低的大腸桿菌CGMCC1.2527(抑菌圈直徑為12.97 mm)，大腸桿菌CGMCC1.0506(抑菌圈直徑為11.87 mm)，大腸桿菌CGMCC1.2222(抑菌圈直徑為11.58 mm)和1株抑菌活性低的大腸桿菌CICC8099(抑菌圈直徑為6.23 mm)。

表1 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌抑菌活性Tab.1 Antibacterial activity of plantaricin BM-1 against Escherichia coli

注：牛津杯內徑為6.00 mm；ATCC，American type culture collection; CMCC，National center for medicial culture collection;CICC，China center of industrial culture collection。

Note： The diameter of Oxford cup was 6.00 mm; ATCC, American type culture collection; CMCC, National center for medicial culture collection; CICC, China center of industrial culture collection.

2.2 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌生長曲線的測定

菌株的生長曲線可以直觀觀察到植物乳桿菌素BM-1的抑制情況。將2.1試驗得到的5株大腸桿菌進行生長曲線的測定，以正常培養的大腸桿菌為對照，結果如圖1所示，菌株4 h進入對數生長期，并保持正常的生長狀態。當加入植物乳桿菌素BM-1后5株菌的生長曲線均出現不同程度的變化。大腸桿菌CGMCC1.8723在12 h后，植物乳桿菌素BM-1作用效果顯著，OD值有一定程度增加，但始終低于對照組。說明植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的生長速度有抑制作用。

2.3 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌活菌數的測定

通過活菌計數進一步分析植物乳桿菌素BM-1對5株大腸桿菌的抑制效果。如圖2所示，5株大腸桿菌呈現典型的生長規律。其中大腸桿菌CGMCC1.8723在4、8、12 h正常菌株的活菌數分別為4.568、7.112、8.776 lgCFU/mL。添加植物乳桿菌素BM-1的活菌數分別為3.396、5.936、8.274 lgCFU/mL，顯著低于對照組大腸桿菌活菌數。表明植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌CGMCC1.8723前12 h的生長具有明顯的抑制作用。

注：CK：對照組；F：添加植物乳桿菌素BM-1的試驗組。Note: CK: Control group; F: Test group addingplantaricin BM-1.圖1 植物乳桿菌素BM-1作用的大腸桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of E. coli under with plantaricin BM-1 treatment

注：CK：對照組；F：添加植物乳桿菌素BM-1的試驗組。Note: CK: Control group; F: Test group addingplantaricin.圖2 植物乳桿菌素BM-1作用的大腸桿菌的活菌計數Fig.2 Viable count of E. coli under with plantaricin BM-1 treatment

2.4 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌生物膜的測定

生物膜是細菌生長的一種保護模式，保護細菌在惡劣的環境下生存[19]。植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌生物膜形成的影響見圖3。添加植物乳桿菌素BM-1后與未添加的對照組相比有顯著差異(P<0.05)，其中植物乳桿菌素BM-1作用效果最明顯的是大腸桿菌CGMCC1.8723，對生物膜的抑制率達38.9%，抑制效果一般是大腸桿菌CGMCC1.2527，大腸桿菌CGMCC1.0506，大腸桿菌CGMCC 1.2222和大腸桿菌CICC8099。結果表明，植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌生物膜的形成有明顯抑制效果。

圖3 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌生物膜的形成量Fig.3 Biofilm formation of E. coli under with plantaricin BM-1 treatment

2.5 植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌甘露糖磷酸轉移酶基因表達的影響

采用玻璃珠-酚仿法進行5株大腸桿菌RNA的提取，結果如圖4所示，提取的RNA分別為23S、16S、5SrRNA，可清晰看到無DNA條帶，說明RNA提取成功。

通過實時熒光定量PCR檢測植物乳桿菌素BM-1添加對5株大腸桿菌manY和manZ基因(參與甘露糖轉運系統是IIC和IID蛋白的編碼基因)表達量的影響。結果如圖5所示，加入植物乳桿菌素BM-1后，manY和manZ在其中4株大腸桿菌中均有不同程度表達。與未添加植物乳桿菌素BM-1的對照組相比，大腸桿菌CGMCC1.0506的manY基因表達顯著升高8.40倍(P<0.05)。大腸桿菌CGMCC1.8723的manZ基因表達顯著升高7.26倍(P<0.05)。添加植物乳桿菌素BM-1導致大腸桿菌的甘露糖磷酸轉移酶系統編碼基因表達量升高。

注： M：Marker DL2000；1：大腸桿菌CICC8099；2：大腸桿菌CGMCC1.0506；3：大腸桿菌CGMCC1.8723；4：腸桿菌CGMCC1.2527；5：大腸桿菌CGMCC1.2222。Note:M:MarkerDL2000;1:E. coli CICC8099; 2:E. coli CGMCC1.0506; 3:E. coli CGMCC1-8723; 4:E. coli CGMCC1-2527; 5:E. coli CGMCC1.2222.圖4 玻璃珠-酚仿法提取RNA的電泳圖Fig.4 Extraction of RNA by glass bead-phenol method

圖5 甘露糖磷酸轉移酶編碼基因表達量Fig.5 Expression of mannose face acid transferase genes with plantaricin BM-1 treatment.

3 討 論

IIa類細菌素成熟肽含37～48個氨基酸，其肽鏈分為兩個區域：帶正電荷、高保守的親水性N端，低保守的親水性或疏水性C端[20,8]。其中在高保守區N端含YGNGV/L共有序列，兩個半胱氨酸形成一個二硫鍵[20,8]。兩種模型解釋IIa類細菌素的作用機制：細菌素會結合受體，導致內在通道的不可逆開放；細菌素將使用受體作為對接分子使肽更接近質膜，允許隨后的細菌素插入與寡聚化形成孔[21]。有研究報道，IIa類細菌素是以細菌的甘露糖透性酶EIItMan為受體進行抑制作用，EIItMan受體屬磷酸轉移酶系統PTS，此系統在某些細菌中主要負責磷酸化和糖的運輸[22]。甘露糖磷酸轉移酶系統PTS中的EIItMan由IIA、IIB、IIC和IID四個結構域組成，例如單核增生李斯特菌的EIItMan由3個亞基組成，其中IIA和IIB為親水性磷酸轉移酶結構域位于細胞質，參與磷酸化；IIC和IID為親水性磷酸轉移酶結構域位于膜上，參與甘露糖轉運[23]。本研究應用管碟法檢測到植物乳桿菌素BM-1對12株大腸桿菌均有不同程度的抑制作用。本研究選取不同敏感型大腸桿菌5株，分析大腸桿菌的生長曲線、活菌數、生物膜形成情況，得到大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1有不同程度的敏感性，其中大腸桿菌CGMCC1.8723對植物乳桿菌素BM-1最為敏感。同時揭示植物乳桿菌素BM-1抑制模式在大腸桿菌的細胞膜上。通過實時熒光定量PCR檢測到大腸桿菌的磷酸甘露糖轉移酶系統編碼基因的表達量均有顯著變化，推測植物乳桿菌素BM-1可能作用于大腸桿菌的EIItMan受體。未來還需進一步探究植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的作用機制。