華蟾素聯用順鉑對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力、凋亡及周期分布的影響

肖聰 張懿敏 孫圣榮

[摘要] 目的 研究華蟾素聯用順鉑對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力、凋亡和細胞周期分布的影響。 方法 體外培養乳腺癌MDA-MB-231細胞。CCK-8法檢測華蟾素聯用順鉑對細胞活力的影響;劃痕實驗檢測華蟾素聯用順鉑對細胞遷移能力的影響;流式細胞術分析華蟾素聯用順鉑對細胞凋亡率及細胞周期分布的影響。 結果 CCK-8結果顯示，與對照組比較，華蟾素組、順鉑組及華蟾素+順鉑組細胞活力降低，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。劃痕結果顯示，與對照組比較，華蟾素+順鉑組遷移能力顯著下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。流式結果顯示，與對照組比較，華蟾素+順鉑組G1期比例顯著增多且凋亡更加明顯，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 華蟾素聯用順鉑能協同抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞活力，可能與誘導細胞周期阻滯于G1期、抑制細胞遷移并促進細胞凋亡有關。

[關鍵詞] 華蟾素;順鉑;乳腺癌;MDA-MB-231細胞

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（c）-0012-05

Effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability， apoptosis and cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells

XIAO Cong*? ?ZHANG Yimin*? ?SUN Shengrong

Department of Breast and Thyroid Surgery， Renmin Hosptial of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan? ?430060， China

[Abstract] Objective To study the effects of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability， apoptosis and cell cycle distribution of breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods Breast cancer MDA-MB-231 cells were cultured in vitro. CCK-8 assay was used to detect the effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability. Scratch test was performed to detect the effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell migration. Flow cytometry was used to analyze the effects of cinobufacini combined with Cisplatin on the apoptosis rate and cell cycle distribution of breast cancer cells. Results CCK-8 results showed that compared with the control group， the cell viability in the cinobufacini group， the Cisplatin group and the cinobufacini+Cisplatin group was decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The scratch results showed that the migration ability of the cinobufacini+Cisplatin group was significantly decreased compared with the control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Flow cytometry showed that compared with the control group， the proportion of G1 phase in the cinobufacini+Cisplatin group increased significantly and the apoptosis was more obvious， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Cinobufacini combined with Cisplatin shows a synergic effect in inhibiting MDA-MB-231 cells， which may be related to the induction of cell cycle arrest at G1 phase， inhibition of cell migration and promotion of cell apoptosis.

[Key words] Cinobufacini; Cisplatin; Breast cancer; MDA-MB-231 cell

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年發病人數高達167萬例，嚴重威脅女性的身心健康[1-2]。化療作為乳腺癌綜合治療中至關重要的一環，發揮著抑制癌癥進展、延長生存時間等作用[3]。順鉑作為乳腺癌術后化療的一線藥物，近年來許多臨床研究表明，鉑類對于復發的晚期乳腺癌均有較好的客觀緩解率[4-5]。但與其他化療藥類似，順鉑的不良反應表現為骨髓抑制、胃腸道反應、神經毒性、腎臟毒性等，在一定程度上限制了其臨床應用[6]。因此尋求通過藥物聯用降低其使用劑量，從而減少其毒副作用是一種有效的解決手段[7]。華蟾素作為一種中藥，具有活血化瘀、化結潰堅、利水消腫、清熱解毒等功效[8-9]。本課題組前期的研究發現，華蟾素對乳腺癌MDA-MB-231細胞有明顯的抑制作用[10]。徐曉武等[9]研究也發現，華蟾素能誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡，作用機制可能與Bax蛋白表達上調并向線粒體轉位有關。由此可見，華蟾素確實能有效發揮抗乳腺癌作用。為了進一步探究華蟾素與傳統化療藥物順鉑是否具有協同作用，本研究用華蟾素聯合順鉑處理MDA-MB-231細胞，研究華蟾素聯用順鉑對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力、凋亡和細胞周期分布的影響，以期為華蟾素聯合順鉑應用于臨床乳腺癌患者的術后化療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231細胞購自中國科學院細胞庫上海保藏中心，取5～10代細胞進行實驗。華蟾素（安徽金蟾生化股份有限公司，批號：160904）;順鉑（Sigma公司，批號：1134357）;DMEM高糖培養基（Hyclone公司，批號：AC0220191）;胎牛血清（Gibco公司，批號：16000044）;1%雙抗（杭州吉諾公司，批號：31800）;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物科技有限公司，批號：KGA107）;CCK-8試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：C0038）。自動酶標儀（型號：Tecan Sunrise，Austria）、流式細胞儀（型號：BD FACSCalibur，USA）均來自武漢大學人民醫院中心實驗室。

1.2 細胞培養

用含有10%新生胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖型培養基培養MDA-MB-231細胞，培養條件為37℃、5%二氧化碳。取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 CCK-8實驗

取對數生長期細胞接種于96孔板中，每孔5×103個，每組設3個復孔，培養24 h。對照組不進行處理。實驗組分別為：①5、10、20、30、40 μg/mL的華蟾素組;②10、20、40、60、80 μmol/L的順鉑組;③不同濃度的華蟾素+順鉑組。繼續培養24 h和48 h后，每孔加入100 μL CCK-8試劑和培養液的混合液（1∶9），避光孵育1 h后，在自動酶標儀450 nm波長處測吸光度值A，細胞活力=（A空白組-A處理組）/A空白組×100%。采用兩藥相互作用指數（coefficient of drug interaction，CDI）評價兩藥相互作用性質，CDI的計算公式：CDI=AB/（A×B）。AB為兩藥聯合使用時與對照組吸光度值的比值，A或B為各藥單獨使用時與對照組吸光度值的比值;當CDI<1時，提示兩藥的相互作用為協同作用;當CDI=1時，提示兩藥的相互作用為相加作用;當CDI>1時，提示藥物的相互作用為拮抗作用。

1.4 劃痕實驗

將MDA-MB-231細胞以每孔5×104個接種于12孔板中，待細胞長到完全融合后，用無菌100 μL槍頭在12孔板每個孔底劃出“十”字線，PBS洗滌2次，再用倒置顯微鏡拍照，然后在每個孔中加入無血清DMEM高糖培養基。對照組不進行處理。實驗組分別為10 μg/mL華蟾素組、20 μmol/L順鉑組及華蟾素+順鉑組。繼續培養48 h后用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合度，拍照記錄。

1.5 細胞周期流式分析

取對數生長期MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，每孔5×105個，培養24 h至細胞貼壁。對照組不進行處理。實驗組分別為10 μg/mL的華蟾素組、20 μmol/L順鉑組及華蟾素+順鉑組。繼續培養24 h后，用胰酶消化并收集細胞，1500 r/min離心（r = 10 cm）5 min后，棄上清并用冷PBS洗滌2次，用預冷的75%乙醇固定過夜。檢測前離心細胞，去掉乙醇，用PBS洗滌2次后，100 μL PBS重懸細胞后加入2 μL濃度為1 mg/mL的核糖核酸酶（RNaseA），37℃水浴40 min后，加入100 μL濃度為100 μg/mL的PI染色液，避光染色20 min后，用流式細胞儀檢測細胞周期的改變。

1.6 細胞凋亡流式分析

同上法處理細胞，取加載結束后培養24 h的各組細胞，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化細胞并收集，1000 r/min離心（r = 10 cm）5 min后，棄去上清液后用冷PBS洗滌2次，加入500 μL binding buffer重懸細胞后，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育20 min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的改變。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件分析實驗數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 華蟾素或順鉑單用對MDA-MB-231細胞活力的影響

CCK-8結果示：華蟾素濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞活力，其中24 h時，20、30、40 μg/mL華蟾素組與對照組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;48 h時，5、10、20、30、40 μg/mL華蟾素能顯著抑制MDA-MB-231細胞活力（P < 0.05或P < 0.01）;順鉑同樣能以濃度依賴性地方式抑制MDA-MB-231細胞的活力，其中24 h時，20、40、60、80 μg/mL順鉑組與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;48 h后，10、20、40、60、80 μg/mL順鉑組能顯著抑制MDA-MB-231細胞的活力（P < 0.05或P < 0.01）。見圖1。

2.2 華蟾素與順鉑單用或聯用對MDA-MB-231細胞活力的影響

濃度分別為5、10、20、30、40 μg/mL的華蟾素組的細胞活力分別為（91.70±6.41）%、（88.77±2.60）%、（82.27±2.37）%、（73.37±0.71）%、（68.90±1.26）%。濃度分別為10、20、40、60、80 μmol/L的順鉑組的細胞活力分別為（93.87±3.38）%、（91.20±1.53）%、（62.83±4.00）%、（49.57±2.08）%、（48.77±0.95）%。華蟾素（5 μg/mL）+順鉑（10 μmol/L）組的細胞活力為（86.67±4.00）%，CDI為1.007，提示此濃度下，兩藥的相互作用為相加;華蟾素（10 μg/mL）+順鉑（20 μmol/L）組的細胞活力為（68.33±4.32）%，CDI為0.844，提示此濃度下，兩藥對乳腺癌的抑制具有協同作用;華蟾素（20 μg/mL）+順鉑（40 μmol/L）組的細胞活力為（40.03±3.51）%，CDI為0.774，華蟾素（30 μg/mL）+順鉑（60 μmol/L）組的細胞活力為（29.73±1.62）%，CDI為0.817，華蟾素（40 μg/mL）+順鉑（80 μmol/L）組的細胞活力為（21.43±1.24）%，CDI為0.745。

2.3 華蟾素與順鉑單用或聯用對MDA-MB-231細胞遷移的影響

48 h后，對照組細胞生長明顯，傷口愈合百分比為（67.2±3.7）%;華蟾素組和順鉑組愈合百分比分別為（53.8±2.4）%、（32.9±2.5）%，與對照組比較差異有高度統計學意義（P < 0.01）;華蟾素+順鉑組的細胞生長稀疏，愈合趨勢緩慢，愈合百分比為（4.0±2.6）%，與其他三組比較差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖2。

2.4 華蟾素與順鉑單用或聯用對MDA-MB-231細胞周期的影響

細胞周期結果表明，MDA-MB-231細胞經順鉑處理24 h后與對照組比較，G1期細胞的比例顯著增加，差異有統計學意義（P < 0.05），而S期細胞比例顯著減少（P < 0.05）;華蟾素組G1期及S期細胞比例與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;而當華蟾素與順鉑聯合用藥時，處于G1期的細胞比例則進一步增加，與對照組及華蟾素組比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），但與順鉑組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。同時華蟾素+順鉑組的S期細胞比例則進一步減少，與對照組及華蟾素組比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），但與順鉑組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。四組G2期細胞比例比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3。

2.5 華蟾素與順鉑單用或聯用對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

細胞凋亡結果表明，與對照組比較，華蟾素組和順鉑組均能顯著促使MDA-MB-231細胞發生凋亡，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），華蟾素+順鉑組的促凋亡作用更顯著，與對照組、華蟾素組和順鉑組比較，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖4。

3 討論

華蟾素是中華大蟾蜍或黑框蟾蜍的全皮經提取加工制成的水溶性制劑，我國傳統醫學認為華蟾素具有活血化瘀、化結潰堅等功效[11-12]。此外，國內外眾多學者的研究也表明，華蟾素對肝癌、結直腸癌、卵巢癌和食管癌等腫瘤具有抑制作用[13-16]。由于華蟾素具有廣泛的抗腫瘤效應，能抑制腫瘤生長，目前已廣泛用于臨床上肝癌、肺癌、食管癌和胃癌等腫瘤患者的綜合治療，可改善患者的生存質量[17-18]。中藥毒副作用小，并能減輕放化療引起的毒副作用，增強化療藥物的殺傷作用[19-20]，因此華蟾素聯用化療藥成為熱門研究。尹宜海等[21]研究提示，華蟾素與三氧化二砷聯用具有協同抑制結腸癌細胞的作用，機制可能與p27、Bax蛋白上調和Bcl-2蛋白下調有關，說明華蟾素聯用化療藥能彼此發揮協同作用，從而達到抑制腫瘤的作用。

華蟾素作為一種新型的抗癌藥物，在卵巢癌和骨肉瘤等實體瘤中已證實其與順鉑聯用具有協同作用，可達到顯著抑制癌細胞的目的[22-23]，然而在乳腺癌的研究中，這兩藥的相互作用卻鮮有報道，因此本研究著力于探究在乳腺癌中，華蟾素與順鉑聯用是否能協同抑制乳腺癌。本研究提示，華蟾素與順鉑均能濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞活力，當10 μg/mL華蟾素聯用20 μmol/L順鉑時，在抑制乳腺癌細胞的過程中發揮協同作用[24]，但隨著藥物濃度的增加，協同作用并未發生顯著提升，提示華蟾素聯用順鉑能在較低濃度下發揮協同作用，并且不隨濃度的增加而增加。隨后，本研究分析了華蟾素與順鉑單用或聯用對細胞周期分布的影響，結果提示，華蟾素或順鉑單用時，均能導致G1期細胞比例增加，兩者聯用時，G1期細胞比例則進一步顯著增加，說明華蟾素或順鉑單用均能導致細胞周期阻滯于G1期，兩藥聯用時，則使這種阻滯效果更加明顯。細胞凋亡結果提示，華蟾素或順鉑單用時均能誘導乳腺癌細胞凋亡，當兩者聯合應用時，凋亡細胞比例則進一步顯著增加，說明兩藥聯合應用比單一用藥誘導腫瘤細胞凋亡作用更加顯著。

本研究初步證實華蟾素與順鉑具有協同抑制MDA-MB-231細胞的作用，可能與協同誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞周期阻滯于G1期、抑制遷移及促進其凋亡有關，本研究將進一步深入展開研究華蟾素聯用順鉑抑制乳腺癌的分子機制，為華蟾素聯合順鉑用于臨床乳腺癌患者的治療提供參考。

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