高效液相色譜串聯蒸發光散射檢測器測定梨中單雙糖含量的研究

王勇 戴麗媛 費騰 趙亞坤 李曉磊

摘 要：為了定量測定梨果實中單雙糖含量，本文以黃金梨、黃冠梨和雪花梨為研究對象，采用高效液相色譜串聯蒸發光散射檢測器，對梨樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖含量進行了測定。高效液相色譜條件：ZORBAX?Carbohydrate（4.6?mm?×150?mm?5μm）色譜柱，30℃柱溫，流動相乙腈水（80：20v/v）溶液，流速1.0mL/min;蒸發光散射器條件：氮氣流速1.8L/min，漂移管溫度100℃。結果表明：在15min[KG-*7]內，測得黃金梨、黃冠梨和雪花梨果實中總糖含量分別為：15.12%、15.05%和13.78%;其中，黃冠梨、雪花梨果糖含量最高，分別占梨果實的6.52%、6.82%;其次為葡萄糖，分別占梨果實的5.08%、4.16%;蔗糖含量最少，分別占梨果實的3.44%、2.80%。而在黃金梨中葡萄糖含量最多，占梨果實的6.67%;果糖次之，占梨果實的6.32%;蔗糖含量最少，占梨果實的2.13%。

關鍵詞：高效液相色譜;蒸發光散射檢測器;梨;果糖;葡萄糖;蔗糖

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190815006

我國梨樹資源豐富，廣泛分布在全國各地;梨樹的栽培面積和梨的產量一直居于世界第1位。梨果實中含有糖類、氨基酸、維生素、膳食纖維、礦質元素等豐富的營養成分，鮮嫩多汁，酸甜適口，因此深受人們喜愛。

梨中可溶性糖的組成和含量對梨果實的營養品質和感官品質有重要影響。不同品種梨由于生長環境、種屬類別等因素的影響，糖組分也會有很大差異[1]。本文以黃金梨、皇冠梨、雪花梨為研究對象，對其中的果糖、葡萄糖、蔗糖含量進行對比。

對糖的傳統測定方法主要有：化學滴定法[2]，分光光度法[2]，高效液相-示差折光法[3，4]。化學滴定法對試劑、操作過程要求嚴格且步驟多、操作復雜、費時，滴定終點受實驗條件影響較大。分光光度法準確度高，操作簡便、快速[2]，但只能測定糖的總含量，不能確定糖分的組成。

高效液相色譜儀常與示差折光檢測器或蒸發散射檢測器相串聯，來檢測糖的組分及含量。

示差折光檢測器法測定存在靈敏度低，系統平衡時間較長，受溫度、流速、基線噪音影響較大，且不能梯度洗脫等缺點。使用蒸發散射檢測器（ELSD）作為測定方法，穩定性好、靈敏度比示差折光法高，可以很好的彌補示差法存在的缺點[1]。

所以本研究采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法來測定3個品種梨中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。

1?材料與方法

1.1?材料

黃金梨（新疆產）、黃冠梨（河北產）、雪花梨（河北產）均購于長春市共和果品超市;果糖、葡萄糖和蔗糖購自上海國藥化學試劑公司，甲醇為色譜純試劑，購自美國熱電飛世爾科學有限公司;二次蒸餾水為自制;其他均為國產分析純試劑。

1.2?定性用對照品溶液的配制

分別稱取1.25g果糖、葡萄糖、和蔗糖對照品，置于50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻。以0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾（聚醚砜，MEMBRANA公司），吸取20μL濾液用于高效液相色譜分析。

1.3?定量用對照品溶液的配制

分別精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖對照品1.00g，置于3個50mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度線，搖勻。作為母液備用。

將果糖、葡萄糖、蔗糖母液分別按濃度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg/mL）進行稀釋。以0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾，吸取20μL濾液用于高效液相色譜分析。

1.4?樣品處理及待測溶液的制備

1.4.1?樣品的冷凍干燥處理

分別將3個不同品種的梨稱重，切成小塊，經組織搗碎機（HGB2WTS3，Waring）粉碎5min，將粉碎后的漿均勻倒入玻璃皿成2mm左右的薄層，稱重，置于冰箱（Simens，博西華家用電器公司）冷凍層-20℃冷凍1h，再經過真空冷凍干燥機（FDU-2100，日本東京理化株式會社）干燥24h，快速放置于玻璃干燥器中，依次快速稱重，快速用研缽磨碎用保鮮膜封存于玻璃干燥器中備用。

1.4.2?樣品的烘干干燥處理

分別將3種不同品種的梨采用上述1.4.1操作冷凍1h后不進行冷凍干燥，直接在105℃的烘箱中過夜烘干，之后快速置于干燥器中，待冷卻至室溫，稱重。

1.4.3?樣品的測定

快速稱取上述樣品粉末0.10g于50mL容量瓶中，加入適量乙腈：水（1：1）混合溶液，在超聲波清洗機中（舒美KQ-300VDE，昆山超聲儀器公司）70℃，45KHz超聲提取0.5h，冷卻至室溫后，再補充乙腈：水（1：1）定容至刻度線，并搖勻[5，6]。以0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾，所得濾液用于高效液相色譜分析。平行試驗3次。

1.5?色譜條件

高效液相色譜儀（Dionex?P680?HPLC?pump，美國戴安公司）;ZORBAX?Carbohydrate色譜柱（安捷倫4.6?mm×150?mm，?5-Micron，美國）;流動相，乙腈：水（80?：?20?v/v）;流速，1.0mL/min;柱溫：30℃;進樣體積：20μL。

1.6?蒸發光散射檢測器條件

蒸發光散射檢測器（Alltech?3300?ELSD，美國奧泰公司）條件：漂移管;溫度：100℃，氮氣為輔氣（流量：1.8L/min）。

1.7?統計分析

采用SPSS23.0統計分析軟件進行數據處理。數據表示為平均值加減標準差，采用LSD法對黃金梨、皇冠梨和雪花梨的果糖含量、葡萄糖含量和蔗糖含量進行多重比較（P<0.05）。

2?結果與討論

2.1?樣品前處理條件的選擇

真空冷凍干燥技術能夠有效的除去水分，且經該技術處理的樣品營養成分損失少[7]。所以，本研究采用真空冷凍干燥法對樣品進行處理。

經真空冷凍干燥后的黃金梨、黃冠梨、雪花梨失去的水分占總質量的比值，分別達83.66%、87.77%和87.66%。經105℃過夜烘干后的樣品黃金梨、黃冠梨、雪花梨失去的總水分占總質量，分別達84.66%、89.01%和89.68%。從中可以看出，烘箱干燥處理的樣品失水量比真空冷凍干燥稍大，但差別保持在2.5%之內。且烘箱干燥處理后的樣品由于高溫處理，樣品發生了褐變，糖組分及含量的變化影響了樣品中糖含量的測定。而真空冷凍干燥處理的樣品可以有效除去水分，其他營養成分損失少。所以本研究采用真空冷凍干燥處理樣品。

梨中主要糖分果糖、葡萄糖、蔗糖都易溶于水，升高溫度可以提高糖的溶解度。使用超聲提取法用乙腈：水（1：1）溶液浸提樣品中糖分，可以使糖分子充分浸出，防止梨中糖分未完全浸出而帶來的誤差。所以本實驗采用浸提溫度為70℃，超聲時間0.5h[8]。

2.2?標準曲線的制定

將1.2中高效液相色譜分析結果得出的3種糖標準譜圖，按上述1.5色譜條件測定峰面積。分別以果糖、葡萄糖、蔗糖梯度濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程及相關系數見表1。3種糖的標準譜圖詳見圖1、圖2、圖3。從3種標準品的譜圖中可以看出3種糖在15min內全部出峰，果糖最先出峰，在7.098min，葡萄糖在8.148min出峰，蔗糖出峰時間最遲，在11.747min。

2.3?樣品色譜圖

按照1.5色譜條件對3種不同品種的梨中果糖、葡萄糖、蔗糖進行測定，樣品色譜圖如圖4、圖5、圖6所示。

用高效液相色譜分離3種糖的樣品譜圖結果表明，本試驗所采用的色譜條件可以很好地分離果糖、葡萄糖和蔗糖。3個樣品譜圖中果糖出峰時間最早，在7.549min左右，葡萄糖出峰時間在8.512min左右，蔗糖出峰時間最晚在12.321min左右，達到了基線分離效果，色譜基線穩定。比較果糖、葡萄糖和蔗糖標準品的譜圖，可以看出，樣品的出峰時間比標準品的出峰時間稍晚一些。

宋曉暉[1]和姚改芳[9，10]的研究結果表明，梨果實中主要糖分為果糖、葡萄糖和蔗糖。與本試驗得出的結果一致。姚改芳[9]的研究中，采用高效液相-示差折光檢測器測定梨果實樣品色譜圖中3種糖的出峰順序依次為蔗糖、葡萄糖、果糖;與本研究采用高效液相-蒸發光散射檢測器檢測法測定梨樣品中3種糖的出峰順序不同。宋曉暉等[1]的研究，采用高效液相-蒸發光散射器測定樣品梨果實中糖含量，為了使梨樣品色譜圖中山梨糖醇和葡萄糖達到更好的分離效果，分別在不同柱溫、流動相流速和流動相比例條件下，測定梨樣品色譜圖。而本研究確定的色譜條件，色譜圖中不會檢測到山梨糖醇，從而避免了山梨糖醇對葡萄糖的影響。

2.4?精密度實驗

分別將果糖、葡萄糖、蔗糖對照品配制成濃度為0.08、0.08、0.04mg/mL的溶液，以0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾，吸取適量濾液用于高效液相色譜分析，按上述1.5色譜條件測定峰面積，外標法定量計算果糖、葡萄糖、蔗糖濃度的相對標準偏差（RSD，n=6），相對標準偏差（RSD）均小于2.7%。故使用HPLC-ELSD法測梨中果糖、葡萄糖、蔗糖精密度較好。詳見表2。

2.5?3種梨樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量

分別取3個品種的梨樣品，按上述1.4方法處理后，以上述1.5色譜條件平行測定4次（n=4），結果詳見表3。

從表3中可以看出，黃金梨、黃冠梨、雪花梨中均含有大量果糖、葡萄糖、蔗糖。黃冠梨、雪花梨果糖含量最高，分別占梨含量的6.52%和6.82%;其次為葡萄糖，占梨含量的5.08%和4.16%;蔗糖含量最少，占梨含量的3.44%～2.80%。而在黃金梨中葡萄糖最多，占梨含量的6.32%;果糖次之，占梨含量的6.32%;蔗糖含量最少，占梨含量的2.13%。3種梨中總糖含量由小到大以此為：雪花梨、黃冠梨、黃金梨。3種不同品種的梨果糖含量無明顯差異，葡萄糖、蔗糖含量有顯著差異，這可能是由于梨的品種及其生長地、日照時間、氣候條件、人為施肥程度、成熟度等因素造成的。

結果表明，黃金梨屬于高果糖、高葡萄糖型，這與宋曉暉等人[1]的研究中新疆梨屬于高果糖、高葡萄糖型相一致。黃冠梨果糖含量最高，蔗糖含量最少，屬于高果糖型;宋曉暉等[1]的研究結果：黃冠梨中果糖占總糖含量最高，達30%左右，蔗糖占總糖含量最少達8.69%左右，屬于高果糖、低蔗糖型。雪花梨果糖含量最高，屬于高果糖型，蔗糖含量最低;高海洋等[11]的研究結果：雪花梨梨汁中果糖含量最高，可達70.49g/L，蔗糖含量最低，達1.638g/L，說明雪花梨為高果糖、低蔗糖型。這表明本實驗以黃金梨、皇冠梨和雪花梨為材料，分析處理得出結果與他人研究得出的結果相一致。

3?結論

對3個不同品種梨利用組織搗碎機磨成果漿，然后采用真空冷凍干燥技術預處理，乙腈：水（1：1）超聲波提取果糖、葡萄糖和蔗糖，再利用HPLC-ELSD法進行定量分析，結合SPSS統計分析軟件，通過差異性可以準確的分析出梨中可溶性糖的組分（主要為葡萄糖、果糖和蔗糖）、含量和不同品種梨中同種糖的差異性比較。本實驗采用的方法可用于梨中糖含量的質量分析與控制，具有實用價值。

參考文獻

[1]宋曉暉，謝凱，李艷麗，等.HPLC-ELSD法測定梨果實中不同種類可溶性糖含量[J].南京農業大學學報，2012，35（2）：87-91.

[2] 楊柳，王建立.糖類物質測定方法評價[J].北京農學院學報，2009，24（4）：68-71.

[3] GB/T2221-2008，食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定[G].

[4] 王震.?HPLC-ELSD法測定蜂蜜中四中糖含量[J].甘肅科技，2014，30（7）：53-54.

[5] 鐘名誠，饒偉文，肖聰.HPLC-ELSD法測定龍眼中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量[J].中國藥品標準，2011，12（1）：44-48.

[6] 宋宏哲，蔣大海，趙勇，等.?HPLC-ELSD法測定大豆糖蜜中國低聚糖的研究[J].中國油脂，2008，33（3）：77-79.

[7] 郭雅翠，杜欽生，朱鳴麗，等.真空冷凍干燥技術在食品工業中的應用[J].農村新技術，2009（4）：24-25.

[8] 袁輝，遠輝，王建玲.HPLC-ELSD法測定新疆不同品種葡萄干中果糖、葡萄糖的含量[J].釀酒科技，2014（10）：102-104.

[9] 姚改芳，吳俊，不同栽培種梨果實糖酸含量特征及形成規律[D].?南京農業大學，2011.

[10] 姚改芳，張紹鈴.10個不同系統品種的可溶性糖與有機酸組分含量分析[J].南京農業大學學報，2011，34（5）：25-31.

[11] 高海燕，王善廣.不同品種梨汁中糖與有機酸含量測定及相關性分析[J].華北農學報，2004，19（2）：104-107.

作者簡介：

王勇（1993-），男，在讀碩士研究生。研究方向：食品生物技術。