蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測定*

孫冰冰，李瑩瑩，常金花，李松濤，趙紅玲，王汝興

（承德醫學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北承德 067000）

蛇床子為傘形科植物蛇床(Cnidium monnieri(L.) Cuss.)的干燥成熟果實，為我國傳統中藥材，含有香豆素類和揮發油等成分，其中蛇床子素是其最主要的香豆素類成分，具有多種藥理學活性。現代藥理學研究表明，蛇床子素具有抗炎、抗腫瘤、抗骨質疏松、抗真菌及肝臟保護等多種藥理學作用，具有良好的研究和開發前景[1-2]。

聚合物膠束是近年來快速發展的一種新型載藥系統，它具有內核疏水、外殼親水的核-殼結構，屬于熱力學穩定體系[3-4]。聚合物膠束的疏水性內核可包載疏水性藥物，增加難溶性藥物的溶解度和穩定性，從而提高難溶性藥物的生物利用度[5]。聚合物膠束的粒徑一般在1～1000nm之間，因而能避免機體對納米藥物的快速清除及免疫系統的吞噬，有利于藥物在腫瘤組織中的積累。此外，聚合物膠束還具有腫瘤細胞靶向，改變抗腫瘤藥物的細胞攝取途徑、亞細胞定位及克服腫瘤多藥耐藥等諸多優點[6-7]，使得其成為難溶性藥物理想的輸送系統。

由于蛇床子素難溶于水，口服后腸道吸收差，故生物利用度較低，影響了蛇床子素的藥理作用。為此，本課題組將蛇床子素制成新型靶向制劑—蛇床子素殼寡糖納米膠束，利用靶向載體技術，以達到提高蛇床子素生物利用度的目的。本研究采用高效液相色譜法測定了該制劑中蛇床子素的含量，以期更好地控制蛇床子素殼寡糖納米膠束的質量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），IKA漩渦混勻儀（上海萊貝科學儀器有限公司）；85-1型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；pHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；超濾離心管（上海駟芮科技有限公司）；透析袋（截留分子量3500，上海源葉生物科技有限公司）。

蛇床子素原料藥（西安天本生物工程有限公司，批號：TBSC20180504-5）；蛇床子素對照品（成都普菲德生物技術有限公司，批號：18032005）；蛇床子素殼寡糖納米膠束（自制，批號：20190316，20190412，20190419）；殼寡糖（濟南海得貝海洋生物工程有限公司）；硬脂酸（天津市東麗區天大化學試劑廠）；端醛基聚乙二醇（mPEG，上海子起生物科技有限公司）；葉酸（FA，美國Sigma公司）；甲酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6mm×200mm，5μm)，流動相甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)，進樣量10μl，流速1.0ml/min，λ=322nm，柱溫為25℃。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取3.0mg蛇床子素，置于10ml容量瓶中，加入流動相溶解并定容，制成300.0μg/ml的蛇床子素對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取2.0mg蛇床子素殼寡糖納米膠束，置于10ml容量瓶中，以適量甲醇超聲溶解，再加入流動相定容，制成200.0μg/ml的蛇床子素殼寡糖納米膠束溶液。精密稱取2.0mg空白殼寡糖納米膠束，置于10ml容量瓶中，以適量甲醇超聲溶解，再加入流動相定容，制成200μg/ml的空白殼寡糖納米膠束溶液。

2.4 專屬性考察 分別精密吸取蛇床子素對照品溶液、空白殼寡糖納米膠束溶液和蛇床子素殼寡糖納米膠束溶液，按照“2.1”的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（附圖）。蛇床子素的色譜峰與基線完全分離，空白殼寡糖納米膠束對蛇床子素的檢測無干擾，表明該分析方法專屬性良好。

附圖 三種溶液的色譜圖

2.5 標準曲線的繪制 將300.0μg/ml的蛇床子素對照品溶液，置于10ml量瓶中，以流動相分別將其稀釋成濃度為0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.13μg/ml、6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml和50.00μg/ml的蛇床子素對照品溶液。按照“2.1”的色譜條件進樣分析，以蛇床子素的峰面積(A)為縱坐標、濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，得標準曲線方程：A=25.03×C-1.513(R=1.000)。結果顯示在0.78～0.00μg/ml的范圍內，蛇床子素的濃度與其峰面積線性關系良好。

2.6 精密度試驗 精密吸取濃度為12.50μg/ml的蛇床子素對照品溶液，連續進樣6次，連續測定3d并記錄峰面積，分別計算日內精密度和日間精密度。結果顯示蛇床子素的日內精密度RSD為0.05%，日間精密度RSD為1.62%，表明精密度良好。

2.7 重復性試驗 精密吸取同一批蛇床子素殼寡糖納米膠束供試品溶液6份過0.45μm微孔濾膜，按照“2.1”的色譜條件進樣測定，記錄峰面積，RSD為0.38%，表明該方法重復性較好。

2.8 穩定性試驗 精密吸取同一蛇床子素殼寡糖納米膠束溶液，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按照“2.1”的色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為1.05%，表明供試品溶液在室溫條件下24h內穩定性良好。

2.9 回收率試驗 分別精密量取1.4ml、1.7ml和2.0ml濃度為100.00μg/ml的蛇床子素對照品溶液各3份，置于10ml容量瓶中，分別加空白殼寡糖納米膠束溶液1.0ml，以流動相定容至刻度，得到濃度分別為14.0μg/ml、17.0μg/ml和20.0μg/ml的供試溶液共9份。按照“2.1”的色譜條件進樣測定并記錄峰面積，計算回收率。結果見表1：

表1 回收率試驗結果

2.10 蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測定 分別取3批蛇床子素殼寡糖納米膠束，按照“2.3”的方法配制供試品溶液，按照“2.1”的色譜條件進樣測定。蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測定結果見表2：

表2 蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測定結果

3 討論

本研究在紫外200～400nm的范圍內對蛇床子素的吸收及分離效果進行了考察，結果表明在波長為322nm處蛇床子素有最大吸收，故確定322nm為蛇床子素的檢測波長。

蛇床子素屬香豆素類化學成分，又稱為甲氧基歐芹酚，為強脂溶性香豆素類化合物，難溶于水，易溶于堿性溶液及甲醇、乙醇、氯仿等有機溶劑。鑒于此，本研究在流動相的選擇上根據文獻[8-9]分別以甲醇-甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸等不同的流動相系統對蛇床子素進行測定。結果顯示以甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)為流動相時，蛇床子素與構成膠束輔料的分離效果最好，峰形較好，且基線平穩、保留時間適中，故選擇甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)為本研究中使用的流動相。以甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)為流動相，采用高效液相色譜法測量了3批蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量，分別為154.0μg/ml、167.2μg/ml和175.1μg/ml。

本研究建立了高效液相色譜法測定蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素含量的方法，結果表明該方法準確、簡單、可靠，且專屬性強，可用于蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測定，為今后蛇床子素新型靶向制劑的深入研究提供了基礎。