絲膠對鏈脲佐菌素作用下大鼠INS-1細胞Bax表達的調控作用*

史 碩，王芳芳，葛 婷，阮鴻嬌，陳志宏△，宋成軍△

（1.承德醫學院人體解剖學教研室，河北承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院）

1972年KERR等三位科學家首次提出了細胞凋亡（apoptosis）的概念[1]。凋亡是具有重要生物學意義及復雜分子生物學機制的生物學現象，用于多細胞生物去除不需要的或異常的細胞，在生物體進化、內環境穩定及多個系統的發育中發揮重要作用，亦與多種疾病的發生發展直接或間接相關，如腫瘤、自身免疫性疾病、1型和2型糖尿病等[2]。Bcl-2蛋白家族在眾多凋亡調控基因中最受重視，Bax是其第二類亞家族成員，可對抗Bcl-2等抑制凋亡基因的作用，促進細胞凋亡[3]。胰島β細胞凋亡與糖尿病發病相關的理論，為糖尿病的治療拓展了一條從基因水平防治糖尿病的新思路。為此，本研究觀察了彩色蠶繭水提物—絲膠對大鼠胰島素瘤細胞（insulinoma cells，INS-1細胞）Bax表達的調控作用，以探討絲膠是否通過抑制胰島β細胞凋亡發揮抗糖尿病作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 絲膠，由承德醫學院蠶業研究所提供彩色蠶繭，按照文獻[4]的方法制備絲膠。大鼠INS-1細胞，購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；四季青胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京索萊寶生物有限公司；兔抗Bax多克隆一抗，艾博抗（上海）貿易有限公司；山羊抗兔IgG二抗，美國KPL公司；Super ECL Plus超敏發光液，北京普利萊基因技術公司；Trizol，北京茂建聯科技有限公司；PCR引物，寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 INS-1細胞的培養和分組 INS-1細胞培養在RPMI-1640培養基中（含10%胎牛血清和50μmol/L的β-巰基乙醇），在37℃、5% CO2培養箱培養，取對數生長期細胞進行實驗。INS-1細胞隨機分為3組：正常對照組、STZ處理組、絲膠保護組。正常對照組細胞，不給予任何藥物處理；STZ處理組細胞，給予由完全培養基配制的STZ溶液（10mmol/L）培養24h；絲膠保護組細胞，給予同時含STZ和絲膠的溶液培養24h，STZ的終濃度同STZ處理組細胞，絲膠的終濃度為300μg/ml。

1.3 INS-1細胞活力的檢測 采用CCK-8法。消化和重懸狀態良好的INS-1細胞，以1×105個/ml的密度接種于96孔板（每孔100μl），每組設6個復孔。細胞貼壁培養48h后給予不同的藥物處理，繼續培養24h取出96孔板，棄掉原來的培養基后使用PBS清洗，每孔加入含10% CCK8溶液的無胎牛血清培養基100μl，在37℃培養箱中孵育2h后，于波長450nm處使用酶標儀讀取吸光度(A)值[5]。以正常組A值為對照，按照干預組A值/正常組A值×100%計算INS-1細胞的活力。

1.4 INS-1細胞Bax表達的檢測

1.4.1 Bax蛋白：采用蛋白印跡法。細胞培養結束后，提取INS-1細胞的總蛋白，并使用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。取所提取蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳（膠濃度15%），然后將蛋白轉至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉過夜，Bax（1：500）、β-actin一抗（1：1000）室溫2h，二抗(1：5000稀釋)室溫2h，Super ECL Plus超敏發光液顯影后掃描條帶。使用Quantity One-v 4.6.2軟件，分析Bax條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為Bax的表達量。

1.4.2 Bax mRNA：采用實時熒光定量PCR法。細胞培養結束后，提取INS-1細胞的總RNA，檢測RNA的純度和濃度，鑒定RNA的完整性后反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，利用熒光定量PCR法擴增Bax和GAPDH片段，每個指標重復3次，所得數據采用2-△△Ct法進行分析計算。Bax引物序列（5’-3’，196bp），F：AGACACCTGAGCTGACCTTGGA，R：TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA；GAPDH引物序列（5’-3’，143bp）F：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，R：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA。

1.5 統計分析 所有計量數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。應用SPSS 21.0統計學軟件，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組INS-1細胞的活力 STZ處理組INS-1細胞的活力較正常對照組明顯降低（P＜0.05），絲膠保護組INS-1細胞的活力較STZ處理組明顯升高（P＜0.05）。見圖1：

圖1 各組INS-1細胞的活力

2.2 各組INS-1細胞Bax的表達情況 STZ處理組INS-1細胞Bax蛋白和mRNA的表達水平較正常對照組明顯升高（P＜0.05），絲膠保護組INS-1細胞Bax蛋白和mRNA的表達水平較STZ處理組明顯降低（P＜0.05）。見附表、圖2-3。

附表 各組INS-1細胞Bax蛋白和mRNA的表達（± s ）

附表 各組INS-1細胞Bax蛋白和mRNA的表達（± s ）

與正常對照組比較：aP＜0.05；與STZ處理組比較：bP＜0.05

組別 Bax蛋白 Bax mRNA正常對照組 0.893±0.015 1.000±0.000 STZ處理組 1.029±0.008a 1.792±0.087a絲膠保護組 0.896±0.010b 1.233±0.068b

圖2 各組INS-1細胞Bax蛋白表達情況

圖3 實時熒光定量PCR法Bax的擴增曲線和溶解曲線

3 討論

糖尿病是由不同病因與發病機理引起的，一組以高血糖為特征的代謝性疾病，糖尿病時高血糖長期存在，可導致各種組織器官，特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙。糖尿病確切的病因目前尚未清楚，研究者們通過多方面綜合研究認為與以下因素有關，遺傳因素、病毒感染、自身免疫、胰島素抵抗、飲食習慣、肥胖等[6]。

研究發現，在糖尿病的早期階段就已經出現胰島β細胞凋亡和胰島體積的縮小，血糖升高、游離脂肪酸增多、胰島淀粉樣物質沉積及炎癥因子等均參與了胰島β細胞的凋亡過程[7]。細胞凋亡受到多種基因的調控，表現為凋亡相關信號通路的啟動和凋亡相關基因的表達[8]；線粒體在所有類型凋亡的執行過程中均發揮重要作用，是多種促凋亡信號因子的共同靶點。在多種凋亡調控基因中，Bcl-2家族成員可通過作用于線粒體調節凋亡相關蛋白的釋放，從而決定細胞存活或凋亡[3]。Bax是Bcl-2家族第二亞家族的重要成員，均含有BH1-BH3結構域。當細胞發生凋亡時，Bax通過作用于線粒體使Cyt-C進入胞質并與細胞凋亡誘導因子結合，啟動caspase相關的凋亡級聯反應[9]；另外，Bax還可以對抗Bcl-2的抗凋亡作用，引起細胞凋亡。并且，Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax還可以直接調控胰島β細胞凋亡[3]。

臨床上傳統以西藥降低血糖治療糖尿病，但西藥的毒副作用，促使人們探尋療效佳、毒副作用少的天然物質。與西醫藥相比，在糖尿病臟腑、氣血、經絡病變的治療中，中醫的整體辨證及靈活的配伍組方具有明顯優勢[10]。中醫認為，應采用陰陽五行的理論科學認識糖尿病。糖尿病的起病臟腑在脾，脾為濕潤之土，被肺胃燥火所烤，失去了潤澤，因此導致脾功能降低，使脾分泌的胰島素相對不足。因此，糖尿病的治療原則是生精清熱、潤燥養陰等。蠶繭為家蠶蛾的繭殼，具有滋陰潤燥、生精止渴的作用，主治腸風便血、淋痛尿血、消渴飲引等，且民間亦有蠶繭泡水輔助降糖的用法[4，11]。

本研究觀察了絲膠對STZ致損傷INS-1細胞細胞活力和Bax表達的影響，以期探尋絲膠降血糖的作用機制。結果顯示，STZ處理組INS-1細胞的活力明顯低于正常對照組、Bax蛋白和mRNA表達明顯高于正常對照組，提示使用STZ成功建立了INS-1細胞損傷模型，并且促凋亡因子Bax可能參與了STZ致INS-1損傷的過程。同時本研究發現，絲膠保護組INS-1細胞的活力明顯高于STZ處理組、Bax蛋白和mRNA表達明顯低于STZ處理組，說明絲膠可對抗STZ對INS-1細胞的損傷、提高INS-1細胞的活力，而這種保護作用可能與絲膠降低Bax的表達進而減少INS-1細胞凋亡有關。

綜上所述，絲膠對STZ致損傷INS-1細胞具有保護作用，其機制可能與絲膠下調Bax的表達有關，但絲膠是否通過下調Bax的表達減少INS-1細胞凋亡，以及絲膠是否還具有調控其它凋亡相關因子的作用，需要深入研究探討。