內側隔核膽堿能神經元參與SNI 神經病理性疼痛大鼠模式分離障礙*

江穎穎 鄭 杰 伊 鳴,4,△

（1首都醫科大學 北京市神經外科研究所，北京100070；2北京大學神經科學研究所；3北京大學基礎醫學院神經生物學系；4 教育部／國家衛生健康委員會神經科學重點實驗室，北京100191）

根據最新的疼痛定義，疼痛是由實際或潛在的組織損傷所引起的感覺和經歷，包括感覺、情緒、認知及社會成分[1]。根據這一定義可知疼痛與認知是緊密相關的。疼痛會導致認知受損，而增加非疼痛相關的認知活動會減輕疼痛[2]。目前臨床上提出了一些非藥物治療慢性痛的策略，如認知行為療法、音樂療法等，這些療法大多數是非創傷性的，成本和風險低[3]。目前臨床上有超過69%的慢性痛病人接受過非藥物治療，對改善患者生活質量有較好效果[4]。因此研究疼痛與認知的關系對研究疼痛機制及治療措施具有很重要的臨床意義。

為了識別外部環境的細微變化，大腦必須區分類似的神經元活動模式，而這是通過“模式分離(pattern separation)”來實現的。模式分離是指將神經回路類似的輸入活動模式轉換成更明顯的輸出模式。模式分離在空間記憶活動中起著非常重要的作用[5]。已有行為學證據表明，海馬齒狀回被認為是“模式分離器(pattern separator)”[6,7]，在模式分離中扮演非常重要的角色。

此外，已有研究表明SNI 神經病理性疼痛會導致海馬雙側齒狀回(dentate gyrus, DG)的新生神經元數目明顯減少[8]。因此我們推測SNI 神經病理性疼痛會導致大鼠模式分離障礙，而這種障礙與海馬齒狀回密切相關。

另一方面，病毒逆行示蹤實驗表明，海馬齒狀回內新生神經元不僅接受來自海馬內部神經元（中間神經元，苔蘚細胞以及成熟顆粒細胞）投射，而且接受內側隔核膽堿能神經元投射[9]，并且齒狀回內神經元新生受到內側隔核內的膽堿能神經元調節。此外，已有文獻表明，當用192 IgG-saporin (SAP)損毀內側隔核膽堿能神經元后，齒狀回內的新生神經元數目明顯減少[10]。因此我們提出假設，SNI 神經病理性疼痛導致的空間認知能力障礙與內側隔核內的膽堿能神經元密切相關。

本研究旨在解決SNI 神經病理性疼痛導致的模式識別障礙與內側隔核中膽堿能神經元的關系，研究內側隔核內的膽堿能神經元是為了進一步探討模式識別的調控機制，為臨床治療治療疼痛提供新的靶點。

方 法

1.實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重為200 ～240 g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供。12 h 晝夜節律交替，其中8:00 ～20:00 為黑暗環境。每籠2 ～4 只大鼠，除了限制飲食時間段外，其余時間大鼠自由飲食、飲水。所有的實驗程序都遵循國際疼痛學會的研究和倫理問題的指導方針[11]，經北京大學醫學部動物保護與使用委員會批準。在進行實驗前，大鼠由實驗操作者多次撫摸(handling)。所有的行為學實驗均為雙盲。

2.實驗方法

（1）部分神經損傷模型(spared nerve injury,SNI)的建立：用1%戊巴比妥鈉（瑞爾欣德科技有限公司，中國北京）麻醉大鼠，對其左后腿進行備皮消毒，沿垂直于左后腿方向剪開皮膚，之后用鑷子鈍性分離肌肉組織，找到坐骨神經三根分支，結扎剪斷其中較粗的脛神經和腓總神經，保留細長的腓腸神經，并且在結扎線遠心端剪去約2 mm 的神經，以防止剪斷的神經重新愈合。之后縫合肌肉及皮膚，用碘酒和酒精消毒傷口以防感染。對照組(sham SNI)組大鼠，除了不剪斷神經外，其余操作同SNI[12]。

（2）機械縮足閾值測定：大鼠SNI 神經病理性疼痛的測定如參考文獻[13]所述，簡單來說，在測試前三天，將大鼠放入測試板適應。正式進行測試時，待大鼠處于安靜狀態，用不同克數的von Frey hair（0.41、0.70、1.20、2.00、3.63、5.50、8.50 和15.10 g）(Stoelting, Wood Dale, IL, 美國)刺激大鼠左后足底外側皮毛交界處。將纖維絲彎曲成S 行，觀察大鼠是否出現包括抬足、舔足、甩足等縮足反應。本研究采用的是“up and down”方法進行，具體過程參見文獻[13]。

（3）八臂迷宮實驗：在為期一周的實驗中，所有實驗大鼠均限制飲食，自由飲水。將大鼠體重保持在實驗開始前體重的80%～90%，此舉是為了保證大鼠對八臂迷宮中的食物有探索欲望。大鼠全程自由飲水。在實驗開始前，將大鼠放入迷宮中適應半個小時，八臂迷宮所有臂的入口處的門均打開，并且在每個臂的末端都放奶酪小球。八臂迷宮周圍用布簾圍起來，并且布簾上放不同形狀的圖案，作為大鼠識別方向的標識。

大鼠進行為期7 天、每天隨機四次的測試。每次測試分為兩步，首先只開放一個固定的臂（見圖1A，B），然后將大鼠放入起始臂，待大鼠進入固定臂，并吃掉奶酪球后，將大鼠取出，用75%醫用酒精消毒迷宮，排除氣味干擾。這次測試的時間上限為2 min，如果大鼠在2 min 內未進入固定臂，則將大鼠指引進入固定臂，并吃掉奶酪球。第二步為隨機開放另一個臂，并在末端放奶酪球，此時迷宮除了起始臂和固定臂（此時未放奶酪球）開放外，多了一個隨機開放的臂，將大鼠再次放入起始臂，記錄大鼠第一次選擇進入的臂。如果選擇隨機開放的臂則為正確，若進入固定臂或者回到起始臂均為錯誤。如果選擇錯誤，則允許大鼠在迷宮中自由探索2 min。根據隨機臂開放的方向，將模式分離(pattern separation)分為S1、S2、S3、S4 四種模式（見圖1A）。統計兩組大鼠每天的正確率，正確率為正確次數/總次數[14,15]。

（4）內側隔核膽堿能神經元損毀：首先使用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，注射劑量為0.55 ml/100 g。將大鼠頭部備皮消毒，沿正中線剪開皮膚，暴露顱骨，以前囟為原點，前囟前(anterior-posterior, AP) 0.6 mm，向左旁開(medial-lateral, ML) 0 mm，用顱鉆鉆開顱骨直至硬腦膜出現，然后輕挑硬腦膜，暴露腦表面，此過程防止出血及碰觸腦組織。將裝有0.5 μl 濃度為 0.35 μg/μl 的 192 IgG-saporin (SAP)（Advanced Targeting Systems, 美國）或者生理鹽水的微量注射器以上述坐標進入腦組織[16]，向下深度為6.8 mm。然后以0.1 μl/min 速度，持續5 min 微量注射藥物，待藥物注射完后，留針5 min，防止藥物隨針道擴散。最后縫合皮膚，全程無菌操作[17]。

（5）免疫組織化學：用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，待大鼠深度麻醉后，剪開腹部組織，暴露心臟，將針頭經心室心房進入主動脈，剪開心耳。首先灌注約400 ml 生理鹽水，以最大速度沖干凈動脈內的血液。之后換上300 ml 左右4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA) 固定組織。前 1/3 的 PFA快速進入動物體內，后2/3 的PFA 降慢速度，以便PFA 滲透進入腦組織。灌流完畢，取腦組織并放入PFA 中于4 ℃冰箱中后固定12 h。之后依次換上20%、30%蔗糖溶液對腦組織進行脫水。脫水過后用包埋劑（Leica，德國）將腦組織包埋，并放入-80℃冰箱中迅速冷凍組織。之后在冰凍切片機進行冠狀面切片，厚度為30 μm，將內側隔核腦片保存在防凍液中。

將腦片放入磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)中漂洗3 × 5 min 后，放入3%雙氧水中，室溫孵育1 h 以滅活腦組織本身的過氧化物酶，此過程注意避光。然后用PBS 漂洗3×5 min，將腦片放入10%羊血清中，室溫封閉打孔1 h。用膽堿能神經元標志物：乙酰膽堿轉移酶(choline acetyltransferase, ChAT) 抗體在4℃冰箱孵育腦片24～36 h，ChAT抗體（AB18736，Abcam，英國）的濃度為1:200。之后用PBS 漂洗3×5 min，之后孵育二抗（中杉金橋二步法免疫組化檢測液），室溫孵育1 ～1.5 h；PBS 漂洗3×5 min 后，用3-二氨基聯苯胺(diaminobezidin, DAB)染色液（A 液:B 液=1:20）（北京中杉金橋公司）室溫孵育腦片約5 min，根據腦片著色深淺做出適當調整，然后裱片，將貼有腦片的載玻片放于37 ℃烤箱中烤2 ～3 d，之后進行梯度酒精脫水，封片，放于顯微鏡（Leica 倒置熒光顯微鏡，DMI 4000B）明場模式下觀察或拍照[18,19]。用image J 軟件計數兩組大鼠內側隔核內的膽堿能神經元數目，即ChAT 陽性神經元數目，然后進行統計分析。

3.實驗動物分組與統計學分析

實驗大鼠分為四組：sham SNI、SNI、假損毀、SAP 損毀，每組7 ～8 只。為保證實驗準確性，數據分析者不清楚實驗分組，使用GraphPad Prism 5.0軟件并采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)和非配對t檢驗(un-pairedttest)進行數據統計。數據以均數±標準誤(±SEM)表示，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

結 果

1.SNI 神經病理性疼痛大鼠模式分離能力降低

根據已有文獻，SNI 導致的神經病理性疼痛在術后24 h 開始出現，并持續至少6 個月。本實驗中，在SNI 造模7 d 后進行模式分離實驗。結果發現SNI 組大鼠在四種模式中的正確率均比對照組低（S1: group effect:F(1,6)= 9.26,P＜0.05, time effect:F(6,6)= 2.99,P＞ 0.05, 見圖 1C; S2: group effect:F(1,6)=280,P＜0.001, time effect :F(6,6)= 25.50,P＜0.001,見 圖 1D; S3: group effect:F(1,6)= 33.60,P＜0.01; time effect:F(6,6)= 0.56,P＞ 0.05, 見圖 1E; S4: group effect:F(1,6)= 30.50,P＜0.01, time effect:F(6,6)= 0.12,P＞ 0.05, 見圖1F; two-way ANOVA with Bonferroni' s post-test）。

此外本研究綜合分析了大鼠在低分辨模式(S2)和高分辨(S3、S4)模式中的正確率，發現不管是在低分辨模式(S2)中，還是在高分辨模式(S3、S4)中，SNI 組大鼠的正確率明顯比對照組低（見圖2A: group effect:F(1,24)= 60.60,P＜0.001; interaction:F(1,24)= 0.01,P＞ 0.05. 見圖 2B: group effect:F(1,24)= 56.99,P＜0.001;interaction:F(1,24)= 0.37,P＞ 0.05, ANOVA with Bonferroni's post-test）。

2.SNI 神經病理性疼痛導致內側隔核膽堿能神經元數目減少

圖1 SNI神經病理性疼痛導致大鼠模式分離能力降低(±SEM)Fig.1 Decreased pattern separation in neuropathic pain rats with SNI(±SEM)

圖2 SNI 和sham SNI 組大鼠在低分辨模式(S2)和高分辨模式(S3、S4)中的正確率(±SEM)Fig.2 Percent of correct choice in neuropathic pain rats in low discrimination (S2) and high discrimination (S3, S4) model in SNI and sham SNI groups (±SEM)

由于海馬齒狀回在模式識別中扮演非常重要的角色[6,7]，而海馬齒狀回接受來自內側隔核膽堿能神經元投射和調控[9]，因此推測內側隔核膽堿能神經元參與SNI 導致的模式識別，接下來檢測了SNI 或sham 術后28 d，內側隔核膽堿能神經元數目的變化（見圖3）。首先對比了SNI 和sham組大鼠的機械痛閾值，SNI 組大鼠機械痛閾值明顯低 于 sham 組（time effect:F(5,80)=36.56,P＜0.001;group effect:F(1,80)= 1375,P＜0.001; interaction:F(5,80)= 35.95,P＜0.001, two-way ANOVA with Bonferroni' s post-test，見圖3A），表明模型成功建立。在SNI 或sham 術后28 d 將大鼠灌流取材，對內側隔核膽堿能神經元進行DAB 染色，對比兩組大鼠內側隔核內的膽堿能神經元數目（見圖3C，D），結果發現SNI 導致內側隔核內的膽堿能神經元數目明顯減少（t= 4.43,P＜ 0.001, unpaired t test，見圖3B）。這一結果表明，內側隔核膽堿能神經元參與SNI 慢性神經病理性疼痛。

3.內側隔核膽堿能神經元損毀明顯降低大鼠空間認知能力

為了證明內側隔核膽堿能神經元是否參與模式識別，首先，使用SAP 特異損毀大鼠內側隔核膽堿能神經元，然后采用模式分離中的S4 模式檢測損毀組與對照組的正確率。因為SNI 會導致模式識別(PS)受損，如果在損毀MS 膽堿能神經元后進行SNI 手術再檢測PS，最后出現的PS 受損沒辦法分清是MS 膽堿能神經元受損還是SNI 導致的。所以我們選擇MS 膽堿能神經元損毀后在正常大鼠中進行PS 實驗。結果發現，損毀組大鼠在S4 中的正確率明顯低于對照組（time effect:F(6,72)= 20.20,P＜0.001; group effect:F(1,72)= 7.80,P＜0.05; interaction:F(6,72)= 0.51,P＞ 0.05, two-way ANOVA with Bonferroni' s post-test，見圖4A）。實驗結束后，將大鼠灌流取材，使用DAB 染色檢測內側隔核內的膽堿能神經元，以此確定損毀是否成功。結果發現損毀組大鼠內側隔核內膽堿能神經元數目明顯少于對照組（見圖4B，C），說明損毀成功。這些結果說明內側隔核膽堿能神經元參與了模式分離。

圖3 SNI神經病理性疼痛導致內側隔核膽堿能神經元數目減少(±SEM)Fig.3 SNI-induced neuropathic pain reduced the number of cholinergic neurons in medial septum (±SEM)

討 論

在處理記憶信息時，海馬中有若干種不同的計算過程，其中一種是模式分離，海馬會用不同的神經活動編碼相似的信息，讓相似的信息變得更加不同，并且在不干擾其他記憶表現的情況下準確形成新的空間記憶[20]。海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)的神經元新生對模式分離非常關鍵[21]。已有研究表明在成年大鼠中存在神經元新生的只有兩個腦區：DG 和室管膜下區(subventricular zone)[22]。關于DG最重要的理論是其參與模式分離。減少DG 內的神經元新生會損害動物在模式分離中的表現，而增加DG 神經元新生明顯提高模式分離的正確率[5～7]。

疼痛包含感覺、情緒、認知和社會成分。神經病理性疼痛會導致大腦很多結構發生改變，包括丘腦、杏仁核、前扣帶回皮質、島葉、前額葉皮質海馬等結構[23]。目前已有研究表明慢性神經病理性疼痛會導致海馬功能異常，包括海馬體積減小、長時程增強缺失、DG 神經元新生降低、細胞凋亡增加等[8]。因此認為SNI 神經病理性疼痛會導致模式分離障礙。我們的結果證實了這一點：在四種模式分離中神經病理性疼痛大鼠正確率均明顯低于對照組大鼠。

DG 新生神經元除了接受來自海馬內神經元的投射（中間神經元、苔蘚細胞、CA3 以及成熟顆粒細胞）外，還接受來自內側隔核(medial septum,MS)的膽堿能神經元投射[9]。并且有研究表明用192 IgG-saporin 特異損毀MS 內的膽堿能神經元會明顯減少DG 神經元新生[10]。因此我們推測SNI 神經病理性疼痛導致模式分離障礙與MS 內的膽堿能神經元有關。我們的結果也證明了損毀MS 膽堿能神經元明顯降低大鼠在模式分離中的正確率。

圖4 損毀內側隔核膽堿能神經元降低神經病理性疼痛大鼠的模式分離能力 (±SEM)Fig.4 Cholinergic neurons lesion in medial septum decreased the pattern separation in neuropathic pain rats (±SEM)

本實驗首先證明了SNI 導致大鼠模式識別受損，同時表明SNI 會降低內側隔核內的膽堿能神經元數目，此外損毀內側隔核膽堿能神經元能明顯降低大鼠模式識別。綜上所述，SNI 神經病理性疼痛導致大鼠模式分離正確率明顯降低，并且這種表現的降低可能與內側隔核內的膽堿能神經元相關。

本實驗存在一定局限性，由于影響模式分離的腦區以及神經元類型很多，為了證實內側隔核膽堿能神經元與SNI 神經病理性疼痛導致的模式分離障礙有關，需要進一步采用更精確的實驗方法，比如化學遺傳、光遺傳以及在體多通道記錄等手段。此外為了更加明確因果關系，可以在持續增加內側隔核膽堿能神經元活性的基礎上進行SNI 造模，看能否逆轉SNI 導致的模式識別正確率降低，這需要進一步證明。