高效液相色譜法測定動物性食品中頭孢喹肟殘留量

張玉潔,沈 昕,李 丹,黃耀凌,李 倩,王鶴佳

(中國獸醫藥品監察所,北京 海淀100081)

頭孢喹肟(Cefquinome,CEF)是動物專用第4代頭孢菌素類抗生素。其抗菌譜廣、抗菌活性強,對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均顯示良好的抗菌活性,對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌屬的成員都有較低的抑菌濃度,尤其對β-內酰胺酶高度穩定。在我國,頭孢喹肟已被批準應用于敏感菌引起的豬、牛呼吸道細菌感染、急性乳房炎等疾病的治療。目前未見有關頭孢喹肟致畸性、致癌性及遺傳毒性試驗數據報道。但長期食用含有頭孢喹肟殘留的食品會對人類健康產生潛在威脅,也易導致耐藥性的產生[1]。

國內外有關頭孢喹肟殘留檢測方法的報道較少,主要集中在動物組織[2~6]及奶[1,7]中頭孢喹肟的檢測,多采用高效液相色譜法和液相色譜-質譜法。但目前的文獻報道及已發布的國家標準中尚沒有一種方法能同時檢測豬、牛的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟及牛奶等9 種組織中該藥物的殘留。因此本研究建立了一種適用于上述9 種動物組織樣品中頭孢喹肟殘留檢測的高效液相色譜法,該方法靈敏度高,適用范圍廣,可以滿足我國農業部235 號公告[8]最高殘留限量的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器設備、試劑與對照品 Agilent1100 高效液相色譜儀(配紫外檢測器);SPE 柱:HLB,60 mg/3 mL;氮吹儀;固相萃取裝置;pH 計;冷凍離心機。

頭孢喹肟標準品(中國獸醫藥品監察所,含量82.6%)、甲酸、磷酸、乙腈(色譜純)、正己烷、正丙醇、高氯酸鈉、超純水。

1.2 溶液配制 頭孢喹肟標準儲備液(1 mg/mL):稱取頭孢喹肟標準品約10 mg,精密稱定于10 mL量瓶中,用50%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度。配制成濃度為1 mg/mL 標準儲備液,4 ℃保存,有效期1 個月。

頭孢喹肟標準工作液(2 μg/mL):準確量取標準儲備液0.1 mL 于50 mL 量瓶中,用50%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度,配制成濃度為2 μg/mL 的標準工作液。4 ℃保存,有效期1 個月。

高氯酸鈉-磷酸緩沖液:取濃磷酸3.4 mL,緩慢加適量水稀釋,再加入水合高氯酸鈉3.45 g,用三乙胺調至pH 值3.6,最后用水定容至1 000 mL。

1.3 液相色譜條件 色譜柱:Phenomenex Luna C18 250 mm×4.6 mm(i.d),粒徑5 μm;流動相:0.1%甲酸+乙腈(88+12,V/V)(牛奶樣品甲酸濃度為0.2%),使用前經微孔濾膜過濾;流速:1.0 mL/min;檢測波長:270 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:50 μL。

1.4 標準曲線及線性范圍的測定 準確量取2 μg/mL 頭孢喹肟標準工作液適量于容量瓶中,用流動相稀釋并定容,制成濃度為10、25、50、100、200、500 ng/mL 系列標準工作液。供高效液相色譜測定。從低濃度到高濃度依次測定,每一濃度進樣3 針。以測得峰面積平均值為縱坐標,對應的標準溶液濃度為橫坐標,繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數。

1.5 樣品前處理 稱取試料2±0.02 g(肝臟、腎臟),4±0.05 g(肌肉、脂肪)或5±0.05 g(牛奶),置于50 mL 離心管中,加入高氯酸鈉-磷酸緩沖液2 mL,乙腈10 mL,渦旋混勻,振蕩5 min,5 000 r/min離心5 min,取上清液于茄形瓶中,再按上述步驟重復提取1 次,合并兩次上清液,加正丙醇5 mL,在40 ℃下旋轉蒸發至近干。殘渣中加入水10 mL 溶解至50 mL 離心管中,再加正己烷5 mL,渦旋混勻,5 ℃下10 000 r/min 離心8 min,取下層清液備用。

HLB 小柱依次用甲醇2 mL 和水2 mL 活化,備用液全部過柱,再依次用水3 mL 和5%乙腈水溶液3 mL 洗滌,抽干。肌肉、脂肪、肝臟、腎臟用流動相2.0 mL 洗脫,牛奶用12%乙腈溶液洗脫。洗脫液收集于10 mL 玻璃試管中,混勻后過0.45 μm 微孔濾膜,供高效液相色譜儀測定。

1.6 檢測限及定量限 分別取豬、牛的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟4 種組織及牛奶的空白樣品進行添加回收試驗,按照上述樣品前處理方法處理,進HPLC 分析,測得各藥物色譜保留處的基線噪音值,求其平均值。以S/N≥10,且在該添加水平的回收率和變異系數均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(LOQ),以S/N≥3 作為藥物的檢測限(LOD)。

1.7 準確度和精密度 采用標準添加法,在豬、牛的肌肉、脂肪空白組織中添加3 個不同濃度(25 μg/kg、50 μg/kg 和100 μg/kg)的頭孢喹肟標準溶液進行回收率測定,每個濃度設定5 個平行樣品,同時進行空白試驗,重復3 次,求每個樣品的回收率和批內、批間相對標準偏差(RSD)。按照相同方法,在肝臟、腎臟空白組織中添加3 個不同濃度(50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg),在牛奶中添加3 個不同濃度(10 μg/kg、20 μg/kg 和40 μg/kg)的頭孢喹肟標準溶液,求每個樣品的回收率和批內、批間RSD。

1.8 樣品穩定性考察 本實驗室目前運行ISO/IEC 17025 實驗室質量管理體系并已獲得中國合格評定委員會(CNAS)認可。依據CNAS-GL03:2006《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》,采用平均值一致性檢驗法評價樣品的穩定性,利用t 檢驗法計算穩定性結果。

從北京某超市購買豬肉樣品,在本實驗室經勻質后按照此方法檢測,未檢出頭孢喹肟殘留。將豬肉充分絞碎攪勻,制成勻質豬肉,稱取樣品20 份,每份(4.00±0.05)g,添加2.0 μg/mL 頭孢喹肟標準工作液100 μL,制成添加濃度為50 μg/kg 陽性添加樣品。制備當天,對其中10 份樣品按照上述方法進行檢測,另外10 份保存于-20 ℃冰箱中,7 d 后取出,按照同樣方法測定頭孢喹肟殘留量。計算回收率,并按照下式計算t 值:

注:為了保證平均值和標準偏差的準確度,n1和n2均≥6。

若t<顯著性水平α(α=0.05)自由度為n1+n2-2 的臨界值(n1+n2-2)tα,則兩個平均值之間無顯著性差異。

2 結果

2.1 標準曲線及線性范圍 取10、25、50、100、200、500 ng/mL 六個濃度點進行檢測。其濃度范圍包含了頭孢喹肟在所有組織的最高殘留限量及該方法的檢測限和定量限。經測定,其線性方程為y=0.108 6x-0.665 5,R2=0.999 9。

2.2 檢測限及定量限 空白試料按相同的步驟處理后,測定結果表明,大部分空白試料對所測分析物無干擾;少部分空白組織在藥物色譜峰保留時間處有較小干擾,通過調整流動相比例可避開干擾物質。圖1 A~C 例舉了標準對照液、牛肝臟空白樣品及添加樣品的色譜圖。

添加適量的標準工作液于2.00 g 空白肝臟、腎臟以及4.00 g 空白肌肉和空白脂肪中,分別制得濃度為25 μg/kg、50 μg/kg 的肝臟、腎臟空白添加試料及濃度為15 μg/kg、25 μg/kg 的肌肉、脂肪空白添加試料。添加適量的標準工作液于5.00 g 空白牛奶中,分別制得濃度為5 μg/kg、10 μg/kg 的牛奶空白添加試料。以上試料經前處理后上機測定,當肝臟、腎臟的添加濃度為25 μg/kg,肌肉、脂肪的添加濃度為15 μg/kg,牛奶的添加濃度為5 μg/kg 時,頭孢喹肟色譜峰信噪比S/N 約等于3(按PtP 算)。當肝臟、腎臟的添加濃度為50 μg/kg,肌肉、脂肪的添加濃度為25 μg/kg,牛奶的添加濃度為10 μg/kg 時,頭孢喹肟色譜峰信噪比S/N 大于或等于10。為此,確定頭孢喹肟在豬、牛的肌肉、脂肪組織中的檢測限為15 μg/kg,定量限為25 μg/kg;在豬、牛的肝臟、腎臟組織中的檢測限為25 μg/kg,定量限為50 μg/kg;在牛奶中的檢測限為5 μg/kg,定量限為10 μg/kg。

2.3 準確度和精密度 根據頭孢喹肟在不同組織中的MRL 規定,在空白試料中添加3 個不同濃度(定量限、MRL 和2MRL)的頭孢喹肟進行回收率試驗,各濃度設置5 個平行樣品,重復3 次,計算回收率及批內、批間相對標準偏差。

試驗結果表明:本方法在25 μg/kg~100 μg/kg添加濃度范圍內,豬肌肉、牛肌肉中頭孢喹肟的回收率范圍分別為60.2%~78.3%、65.4%~100%,豬脂肪、牛脂肪中頭孢喹肟的回收率范圍分別為60.4%~79.7%、71.0%~98.5%,在50 μg/kg~200 μg/kg 添加濃度范圍內,豬肝臟、牛肝臟中頭孢喹肟的回收率范圍分別為61.4% ~94.3%、61.8%~98.6%,在50 μg/kg~400 μg/kg 添加濃度范圍內,豬腎臟、牛腎臟中頭孢喹肟的回收率范圍分別為60.6% ~93.0%、61.3% ~97.2%。在10 μg/kg~40 μg/kg 添加濃度范圍內,牛奶中頭孢喹肟的回收率范圍為60.3%~100%。批內與批間相對標準偏差均小于20%。

圖1 標準對照液、牛肝臟空白樣品及添加樣品色譜圖

2.4 穩定性 根據樣品穩定性考察方法,制備樣品當天及7 d 后,對樣品進行了穩定性檢驗,兩次檢測結果進行比較,得到的t 值

3 討論

3.1 提取條件的優化 現有的文獻及標準中大多采用緩沖溶液[2-3]、乙腈[1,4]及乙腈水溶液[5,7]提取動物組織中的頭孢喹肟。試驗摸索發現,用緩沖溶液提取組織樣品中的頭孢喹肟雜質干擾明顯。嘗試用乙腈濃度為67%至83%乙腈水溶液以及純乙腈對藥物進行提取,組織及牛奶中的提取回收率僅在30%~60%范圍內,不能滿足殘留檢測的要求。其中83%乙腈水溶液提取回收率較高,約為40%~60%,其他濃度以及純乙腈的提取回收率更低。因此本試驗對提取液的極性及pH 值進行了摸索,結合頭孢喹肟的藥物結構性質,在83%乙腈溶液的基礎上用不同pH 值的酸性緩沖液代替水,與乙腈按照1∶5比例混合進行提取。在同樣操作條件下比較測試,發現用0.05 mol/L 磷酸緩沖液(三乙胺調節至pH 值3)2 mL 與乙腈10 mL 混合共同提取組織中的頭孢喹肟,既能沉淀蛋白去除雜質,又能保證回收率達到60%以上。進一步參考劉利鋒等人[6]的液相色譜流動相條件,發現緩沖液中加入高氯酸鈉后提取效率有了進一步提高,因此確定了用高氯酸鈉-磷酸緩沖液(pH 值3.6)2 mL 加乙腈10 mL 共同提取各組織中的藥物。又對20 mL 提取液一次提取和12 mL 提取液分兩次提取的提取效率進行了比較,顯然后者的提取效率更高,所以最終確定了12 mL 提取液分兩次提取的方案。

表1 樣品穩定性檢驗結果

3.2 凈化條件的優化 HLB 小柱對頭孢喹肟保留能力較好,又容易洗脫,因此很適合用于動物組織中頭孢喹肟的凈化。在摸索HLB 小柱洗脫條件時發現,對于豬、牛的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟,直接用流動相2 mL 就可以充分洗脫,而對于牛奶樣品,用流動相洗脫,藥物回收率幾乎為零。配制不同濃度的乙腈水溶液,對牛奶樣品的洗脫液比例進行重新摸索,試驗結果顯示,用12%乙腈溶液2 mL 進行洗脫,柱回收率可達85%以上,乙腈濃度降低會造成洗脫不完全,乙腈濃度升高會則同時洗脫出更多雜質。

3.3 色譜條件的優化 C18 色譜柱的硅膠基鍵合固定相表面存在一定量的游離硅醇基,由于頭孢喹肟結構中的胺基和羧基能在水中發生解離,固定相表面的這些游離硅醇基可通過氫鍵或離子交換作用強烈吸附頭孢喹肟,出現色譜峰拖尾,保留值不穩定等現象,導致峰形異常和分離度下降[6]。流動相中加入甲酸,改變系統pH 值,有助于改善頭孢喹肟色譜峰峰形,提高分離度,穩定保留時間。0.1%甲酸含量對于改善豬、牛各種組織中頭孢喹肟的分離恰到好處,但對于牛奶樣品來說效果不甚理想。濃度增加至0.2%則可有效改善頭孢喹肟色譜峰峰形,將其與雜質分開。濃度繼續增加,不再有明顯效果。對于不同來源的牛奶樣品,在0.2%甲酸+乙腈(88+12,V/V)的基礎上細微調整兩項比例即可使藥物與雜質有更好的分離。

3.4 適用組織的優化 頭孢喹肟是動物專用的第1 個第4 代頭孢菌素,我國農業部235 號公告[8]明確規定了該藥物在豬、牛的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟及牛奶中的殘留限量,但目前的文獻報道[1~7]中尚沒有一種方法能同時應用于上述各組織中該藥物的殘留檢測。國家標準[9]及行業標準中也尚未有同時涵蓋豬、牛動物組織及牛奶的檢測方法。因此,為了給我國最高殘留限量規定提供技術支持,為適應我國現階段食品安全檢測工作的需要,本方法通過對提取、凈化及色譜分離等分析環節的逐一優化,建立了適用于豬、牛的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟及牛奶樣品中頭孢喹肟殘留的檢測方法。同時,對于頭孢喹肟這類檢測限量較高的藥物而言,高效液相色譜檢測法具有成本低、普及率高、操作簡單等優點,更適合基層檢測工作的需要。