豬源殺鮭氣單胞菌分離鑒定及毒力因子檢測

鄧同煒,蔣增海,,霍元楠,宋 浩,何啟蓋

(1.河南牧業經濟學院動物醫學院,河南 鄭州450046;2.河南省豬病防控工程技術研究中心,河南 鄭州450046;3.華中農業大學 農業微生物國家重點實驗室,湖北 武漢430070)

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida),是一種最早被認識的魚類病原菌,廣泛分布于淡水與海水中,除了作為人們最為熟知的鮭魚病原菌外,還可感染其他許多魚類品種,該菌分為5 個亞種,分別為殺鮭亞種(A.salmonicida subsp.salmonicida)、無色亞種(A.salmonicida subsp.achromogenes)、殺日本鮭亞種(A.salmonicida subsp.masoucida)、殺田唇烏蠅翼亞種(A.salmonicida subsp.smithia)和彭氏亞種(A.salmonicida subsp.Pectinolytica)[1]。Varshney A首次報道了1 例白內障病人手術后2 周感染眼內膜炎,是由殺鮭氣單胞菌導致[2]。Fontes 報道從屠宰場采集豬胴體、膈肌、脫毛器、糞便和水等樣品中,分離氣單胞菌,最后分離到嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌等9 個品種的氣單胞菌[3]。

2016 年10 月,河南漯河某養豬場存欄保育仔豬50 多頭,于2 周前,豬群的蹄部、口腔出現水皰,疑似口蹄疫感染,自愈后,又開始發病,臨床癥狀表現為咳嗽、喘氣、體溫升高等,死亡3 頭,送檢1 頭典型癥狀死亡的病例,剖檢病變為肺臟充血、出血性病灶,脾臟淤血、邊緣有梗死。養殖戶反映,病初時懷疑為呼吸道病感染,使用強力霉素、阿莫西林或磺胺類藥物等拌料治療,無效,然后送檢本室診斷。通過臨床癥狀和病理剖檢,懷疑為細菌感染,通過無菌采集病料,首次從發病豬體內分離到一株殺鮭氣單胞菌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 綿羊鮮血瓊脂平板,購自鄭州博賽生物有限公司;營養肉湯、普通營養瓊脂,購自北京奧博星生物技術有限責任公司;2×Taq PCR Master Mix,購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DL-2 000 DNA Marker、瓊脂糖和核酸染料,購自寶生物工程(大連)有限公司;生化試管,購自青島海博生物技術有限公司;MH 瓊脂、藥敏紙片,購自英國Oxoid 公司;大腸桿菌(ATCC25922)為質控菌,由揚州大學人獸共患病學江蘇省重點實驗室惠贈。體重為20 g~25 g 健康昆明系小鼠由本校動物房提供。

1.2 細菌分離培養與染色鏡檢 無菌采集發病豬的肺、肝臟和脾臟,75%酒精棉球擦拭病料,并引火自燃,除去表面雜菌,同時火焰燃燒消毒剪刀、鑷子,剪去外表面的組織,取深部組織,接種血瓊脂平板,37 ℃恒溫培養24 h,挑取形狀、大小和顏色一致的優勢菌落,進一步接種血瓊脂平板,純化2~3 代。同時,挑取純化后的單菌落涂于載玻片,以無菌生理鹽水混勻,自然干燥,火焰上加熱固定,通過革蘭染色后顯微鏡下觀察。

1.3 分離菌的16S rDNA 分子鑒定 水煮沸法提取分離菌株的DNA 模板,參照文獻[4],合成通用引物 (16S-27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,16S-1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′),利用PCR 技術擴增16S rDNA 片段,預期擴增大小約1 500 bp,擴增結果送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序16S rDNA 結果 在NCBI GenBank 數據庫中進行BLASTn 比對,鑒定菌種。

1.4 分離菌的生化試驗 使用細菌微量生化反應管,按生產廠家說明書要求的條件培養,并在規定的時間內觀察結果,參照文獻[5]進行結果判定。

1.5 分離菌的小鼠致病性試驗 將分離純化菌株,接種于營養肉湯中,37 ℃恒溫條件下,過夜培養,然后將其稀釋為5×108CFU/mL 菌液,采取灌胃接種,每只小鼠接種0.2 mL,共接種4 只。同樣,選擇4只小鼠作為對照組,每只小鼠接種無菌營養肉湯0.2 mL。觀察2 周,記錄小鼠的臨床表現。

1.6 分離菌的藥敏試驗 以大腸桿菌(ATCC-25922)為質控菌株,按照世界衛生組織(WHO)推薦的K-B 和參照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)手冊方法[6],對分離菌株進行藥敏試驗,其結果按照上述手冊進行判讀。

1.7 分離菌的毒力基因檢測 水煮沸提取細菌DNA 模板,參照文獻[7],合成6 對引物(見表1),利用PCR 技術擴增分離菌株的毒力基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 擴增不同毒力基因引物序列

2 結果與討論

2.1 細菌分離培養與染色鏡檢結果 無菌采集肺臟、肝臟和脾臟,分別接種于血瓊脂平板,37 ℃恒溫培養24 h 后,均能生長成一種乳白色、濕潤、半透明、β 溶血、大小為2 mm~3 mm 的中心凸起呈圓錐形的優勢菌落。革蘭染色為一種革蘭陰性桿菌,無芽孢和莢膜(見中插彩版圖1)。

圖1 分離菌株為革蘭陰性桿菌

2.2 分離菌的16S rDNA 分子鑒定 該分離菌株的16S rDNA 片段PCR 擴增后,電泳檢測顯示獲得約1 500 bp 目的條帶(圖略)。擴增產物測序比對分析后,其結果顯示分離菌株與NCBI GenBank 數據庫中殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種YZ-1 株的同源性最高,為99%。因此,將分離菌株鑒定為殺鮭氣單菌殺鮭亞種。

2.3 分離菌的生理生化特征 生化試驗結果顯示,氧化酶試驗為陽性,吲哚試驗、V-P 試驗陰性,甲基紅陽性,H2S 和脲酶試驗為陰性,苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶為陰性,精氨酸雙水解酶為陽性,D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、麥芽糖、D-甘露醇、海藻糖、ONPG 為陽性,丙二酸利用鹽、乳糖、纖維二糖、棉籽糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-山梨醇為陰性。分離菌株符合殺鮭氣單胞菌特征。

2.4 分離菌的小鼠致病性試驗 4 只小鼠攻毒接種以后,第3 天,均開始發病,表現為精神不振,倦怠,不愿走動,怕冷,第4 天死亡1 只,剩下3 只小鼠,2 周后康復;4 只對照小鼠均正常。本試驗表明分離菌株對小鼠具有一定致病性。

2.5 分離菌的藥敏試驗 藥敏試驗結果表明,該分離菌對磺胺異噁唑、四環素、土霉素、阿莫西林/克拉維酸、卡那霉素、氨芐西林、頭孢唑啉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶耐藥;對慶大霉素、阿米卡星、頭孢噻呋、恩諾沙星、環丙沙星等敏感;對氯霉素中介(表2)。從藥敏試驗結果來看,該分離菌株耐藥性嚴重,多種藥物均不能作為治療用藥,應該根據藥敏試驗結果,選擇敏感的藥物如頭孢噻呋、慶大霉素或者恩諾沙星進行治療。

表2 藥敏試驗結果

2.6 分離菌的毒力基因檢測 該分離菌株毒力基因PCR 檢測結果顯示,6 個被檢測毒力基因中act、ast、fla、lipase 檢測為陽性,alt、elastase 檢測為陰性(圖2),表明該分離菌株可能具有致病性。

圖2 毒力因子PCR 檢測結果

3 討論

針對人類,基于感染頻次,氣單胞菌臨床感染分為四大類:1.胃腸道綜合征;2.外傷和軟組織感染;3.菌血癥感染,例如免疫低下敗血癥感染;4.其他方面各種各樣的很少發生的感染[5]。因此,免疫力低下人群,容易患氣單胞菌的腸道外感染。本研究首次從疑似口蹄疫自愈后的病死仔豬體內,分離到1 株殺鮭氣單胞菌,表明豬群在感染口蹄疫后,造成免疫力下降,存在感染殺鮭氣單胞菌的風險。

本研究藥敏試驗結果,表明該豬源殺鮭氣單胞菌分離菌株對獸醫臨床常用藥物如磺胺類藥物、四環素類藥物、β-內酰胺類抗生素均耐藥,是導致養殖戶在送檢前進行治療失敗的原因。據筆者調查,當前養豬戶十分喜愛使用磺胺類藥物、強力霉素、阿莫西林或者氟苯尼考等粉劑拌料,用于預防或者治療豬病,可能是導致豬場病菌對這些藥物產生廣泛耐藥的基礎,應該引起注意;當遇到治療細菌性豬病失敗時,必須結合藥敏試驗結果,選擇敏感性藥物進行治療,減少損失。

由于殺鮭氣單胞菌屬于魚類病原,以前沒有該菌感染豬群的報道,本次豬群殺鮭氣單胞菌屬首例,屬于跨種傳播感染。那么殺鮭氣單胞菌是從何處來的呢?是從環境中而來,還是從飼料中水產品攜帶而來呢?本次病例屬于偶然情況,還是具有普遍意義?有待于進一步調查研究。