狂犬病病毒實時熒光RT-RPA 等溫檢測方法的建立

譚理琦,鄭曉聰,王翠萍,李汶松,秦智鋒

(1.深圳市福田區動物防疫監督所,廣東 深圳518045;2.深圳出入境檢驗檢疫局,廣東 深圳518045;3.廣東藥科大學食品科學學院,廣東 廣州510000)

狂犬病病毒(RV)屬彈狀病毒科,狂犬病病毒屬,是有囊膜的單股負鏈RNA 病毒[1]。據世界衛生組織統計,目前全球已有87 個國家報道過狂犬病[2]。狂犬病病毒具有廣泛的宿主感染后能夠破壞神經元細胞,同時在動物的中樞神經系統中大量繁殖,目前尚無有效的治療措施。被犬咬傷是狂犬病病毒的主要傳播途徑,此外,狂犬病還可通過消化道、抓傷、舔或觸摸傷口、母體胎盤、呼吸道等途徑傳播[3]。因此,對RV 建立快速、準確的檢測方法是控制RV 感染的首要條件。

聚合酶重組酶擴增技術(Recomninase Polymerase Amplification,RPA)是一種新型的等溫擴增技術[4],其基本原理是在恒溫條件下,重組酶與寡核苷酸引物結合,形成酶和引物的復合體,酶促使引物定位在DNA 雙鏈模板的同源靶序列上,并在單鏈DNA 結合蛋白的協助下,解鏈模板DNA,隨后在DNA 聚合酶的作用下,形成新的DNA 互補鏈,從而實現了擴增[4]。

RV 基因組主要編碼5 個主要的結構蛋白:核蛋白(N),磷酸化蛋白(P),基質蛋白(M),糖蛋白(G)和RNA 多聚酶(L)[5]。其中核蛋白(N)是狂犬病病毒相對穩定并且拷貝數最多的蛋白,其作用是刺激機體產生免疫[6-7]?？袢〔《綪V 株、ERA株以及CVS 株等核蛋白的氨基酸序列同源性高達98%以上,且含有兩個高度保守的區域[8-10]。因此本文主要針對狂犬病病毒N 基因保守區結合熒光RPA 技術,設計特異性的引物,建立能夠快速、高效的檢測RV 的熒光RPA 等溫檢測方法,為我國RV的防控和診斷提供一種新型可靠的技術。

1 材料與方法

1.1 病毒 犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細小病毒、副流感病毒均為滅活病毒,Rabigen?mono 狂犬病滅活疫苗(VP12 株)、寵必威?銳必威犬、貓狂犬病病滅活疫苗、瑞貝康Rabisin?狂犬病滅活疫苗(G52 株)以及狂犬病病毒(CVS-11、JX-08-45)核酸由深圳市福田區動物防疫監督所提供,臨床樣品為深圳市福田區動物防疫監督所從寵物醫院采集。

1.2 主要儀器和試劑 超微量核酸蛋白濃度分析儀(BioDrop 公司)、T16-ISO 等溫擴增熒光檢測儀(TwistDX 公司),純化試劑盒(Esay Pure Quick Gel Extraction Kit 公司)、核酸提取試劑盒(TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 公司)、質粒純化試劑盒(TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification Kit 公司)、RT-PCR 試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit 公司)、RPA 核酸擴增試劑。

1.3 引物和探針的設計與合成 參考NCBI 網上的數據,利用DNAStar 進行序列的同源性對比分析,選取N 基因高保守序列擴增。利用Oligo 軟件設計6 對引物和探針,序列如表1。

表1 RPA 的引物和探針

1.4 病毒RNA 的提取及濃度測定 采用核酸試劑盒(TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 公司)提取犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細小病毒、副流感病毒、狂犬病病毒(CVS-11、JX-08-45)與Rabigen?mono 狂犬病滅活疫苗(VP12 株)、寵必威?銳必威犬、貓狂犬病滅活疫苗、瑞貝康Rabisin?狂犬病滅活疫苗(G52 株)的RNA,用超微量核酸蛋白濃度分析儀測定核酸濃度。

1.5 熒光RT-RPA 反應體系及反應條件 熒光RT-RPA 擴增使用試劑盒TwistAmp exo RT(TwistDx公司)進行試驗,先把再水化緩沖液29.5 μL 加入到凍干酶球的反應管中,然后加入10 μmol/L 的引物各2.1 μL,10 μmol/L 的探針0.6 μL,DEPC 水11.2 μL,模板2 μL,最后加入280 mmol/L 的醋酸鎂溶液2.5 μL,混勻,置于T16-ISO 等溫擴增熒光檢測儀中,39 ℃運行20 min,實時觀察檢測結果。

1.6 引物及探針的篩選 將設計的4 條引物和1條探針(見表1)進行配對組合,以狂犬病病毒核酸為模板,根據1.5 中反應體系進行配置,篩選出較優的組合作為本次試驗的引物與探針。

1.7 靈敏性試驗

1.7.1 標準質粒構建 根據RV N 基因序列設計引 物,序 列 如 下,RV-N-F:5′-ACGCTTAACAACAAAACCATAGAAG-3′; RV-N-R: 5′-CGGATTGACGAAGATCTTGCTCAT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以狂犬病病毒核酸為模板,使用引物RV-N-F、RV-N-R 進行RT-PCR 擴增,體系為:2× One Step RT-PCR Buffer 12.5μL,PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0 μL,20 μmol/L 的上下游引物各0.5 μL,無菌水8.5 μL,模板2 μL。按以下條件進行反應:逆轉錄50 ℃30 min;預變性94 ℃2 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,共30 個循環;然后72 ℃10 min,4 ℃保存。

將擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收,連接到pMD18-T Vector,轉化入大腸桿菌DH5α 感受態細胞中構建重組菌pMD18-T-N/DH5α。選擇陽性克隆鑒定正確后過夜培養提取質粒,使用超微量核酸蛋白濃度分析儀對質粒濃度進行測定并計算質粒的拷貝數。

1.7.2 靈敏度測試 將篩選的引物與探針進行靈敏度測試。將上述構建好的質粒標準品作10 倍梯度,并用ddH2O 作陰性對照,進行熒光RPA 擴增。

1.8 特異性試驗 以狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細小病毒、副流感病毒等犬類相關病毒進行測試。

1.9 臨床應用 從寵物醫院采集的樣品以及購置的狂犬病病毒疫苗,共19 份樣品,提取核酸后,作為臨床樣品進行檢測。同時與標準《SN/T 4087-2014狂犬病檢疫技術規范》所述的熒光PCR 方法進行比對,測試方法的臨床效果。

2 結果與分析

2.1 引物探針的確認 用狂犬病病毒核酸為模板,以引物RV F1/R1、F1/R2、F2/R1、F2/R2 等組合并結合探針RV P 進行測試,并做陰性對照,結果見封三彩版圖1,各組合均能對狂犬病病毒核酸進行擴增,其中引物F1/R1 組合擴增曲線起飛時間較早,選為本研究的較優引物,進行進一步試驗。

2.2 靈敏性試驗 將質粒標準品進行10 倍系列稀釋,其核酸濃度為1.83 Copies/μL ~ 1.83×109Copies/μL,并做陰性對照,用熒光RT-RPA 進行靈敏度試驗,結果見封三彩版圖2。

結果顯示,模板濃度為1.83×101Copies/μL ~1.83×109Copies/μL 1 h,可看到明顯的擴增曲線,濃度為1.83 Copys/μL 無擴增曲線。因此,在本次試驗中RPA 方法的最低可檢測的核酸濃度為1.83×101Copys/μL。由此可見,熒光RT-RPA 方法有很高的靈敏度,并且檢測時間只需20 min,一般情況下運行5 min就可觀察到擴增曲線,并可實時觀察擴增曲線。

2.3 特異性試驗 以狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細小病毒、副流感病毒為RNA 模板,采應用熒光RT-RPA 進行特異性檢測,并用ddH2O作陰性對照。結果見封三彩版圖3 顯示,以狂犬病病毒為模板有明顯的擴增曲線;而犬瘟熱病毒、傳染性肝炎病毒、細小病毒、副流感病毒等樣品無擴增曲線。因此,本試驗建立的檢測狂犬病病毒的熒光RT-RPA 方法具有較好的特異性。

2.4 臨床樣品檢測 從寵物醫院采集的臨床樣品以及購置的狂犬病病毒疫苗,共24 份樣品,提取核酸后,進行熒光RT-RPA 檢測。同時與標準《SN/T 4087-2014 狂犬病檢疫技術規范》所述的熒光PCR方法進行比對,結果顯示,3 株狂犬病滅活疫苗均為陽性,其他動物樣品結果呈陰性,熒光RT-RPA 檢測結果與標準方法檢測結果一致。

圖1 RPA 檢測RV

圖2 靈敏性試驗

圖3 特異性試驗

3 討論

狂犬病全球范圍內流行,感染后死亡率極高。建立一種準確、快速的RV 檢測方法對我國防控該疫病具有重大意義。目前已有多種RV 檢測方法及應用,如2007 年王曉虎[11]利用熒光抗體病毒中和試驗將定量血清與狂犬病病毒CVS 在體外中和,2008 年張靜文[12]應用RT-PCR 技術擴增RV N 基因,2011 年黃元[13]建立了檢測狂犬病病毒核酸RT-LAMP 技術。然而各種技術都存在一定的優勢與不足,如:熒光與抗體病毒中和試驗,此方法在細胞培養上的效果最好,但野外采集的血清質量低劣,在試驗進行時細胞會對毒素太過敏感從而產生假陽性。RT-PCR 在大規模樣品的初步篩選中結果直觀,容易判定,但是結果也會受非特異性序列變異、病毒稀釋間接性、樣品采集時間、樣品類型等影響。而RT-LAMP 等溫擴增技術,現如今已運用于多個領域,該技術于PCR 技術相比,具有更高的靈敏度和特異性,反應快速,70 min就可以顯示結果,同時不需要電泳,可添加著色劑直接用肉眼判斷結果。然而,該技術的原理復雜,需要設置多對引物,對引物的要求極高,同時該檢測方法的靈敏度極高,容易出現假陽性[14-15]。

本試驗結合重組酶聚合酶擴增技術,建立了RV-RPA 檢測方法。通過了靈敏度、特異性以及臨床檢驗驗證,確定了檢測方法的可靠性?？袢〔《境臃N狂犬疫苗外,無其他有效的治療方法,因此接種疫苗以及早期的診斷極為重要。然而高靈敏度是作為診斷技術中的重要參數之一,高靈敏度可以更有效的判斷家畜以及人類體內是否含有狂犬病病毒,為盡快采取有效措施提供依據。特異性強。試驗結果顯示,該檢測體系除狂犬病病毒檢測為陽性,其余犬類病病毒檢測結果皆為陰性,表明建立的方法特異性強,更加肯定RPA 技術的實用性。RPA技術不僅儀器簡便,檢測條件也很簡單。反應溫度為39 ℃,無需變溫,消耗時間短,20 min 即可得到檢測結果。加入熒光探針,可以實時觀察到檢測結果。

目前,RPA 技術已被廣泛應用于快速檢測動物疫病,如Aebischer、Abd、Wang 等[16-18]應用等溫擴增技術對動物疫病進行檢測。因此,RV 熒光RPA檢測體系相對于其他檢測狂犬病病毒的檢測方法,具有明顯的優越性,也為實現現場檢測提供一種可能。然而,RPA 作為一種新興的技術,還存在很多不足。其中引物和探針的設計是該方法成功與否的關鍵。RPA 技術中引物和探針的設計沒有PCR技術發展得這么成熟,沒有特定用于該引物和探針設計的軟件,只能借鑒PCR 引物設計的軟件進行設計。不過RPA 結果真實可靠,且該方法反應操作簡便、對儀器要求較低,非常適用于基層診斷實驗室和養殖場檢測。隨著RPA 技術的不斷改進,該技術一定可以得到快速的發展與應用。