補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道環境和黏膜結構的影響

靳雙星,張桂枝,王學強,張 瀟

(1.河南牧業經濟學院動物醫學院,河南 鄭州450046;2.河南牧業經濟學院動物科技學院,河南 鄭州450046;3.開封市動物疫病預防控制中心,河南 開封475000)

近年來,通過微生物發酵手段炮制中藥的研究越來越受到重視,并取得了一定進展[1-4],發酵過程可以改變中藥的原始生物活性物質和營養成分,經過微生物發酵處理后的中藥富含維生素、酶和生長因子[5-6]。發酵中藥與未發酵中藥相比,可較大幅度地改變藥性,提高療效,降低毒副作用,擴大適應癥,已成為中藥研究與開發的熱點[7]。現代藥理研究顯示,補中益氣湯具有調整胃腸運動,調節胃酸與胃蛋白酶分泌,增強小腸對葡萄糖吸收,增加胰液分泌等功效[8-10]。因此,本課題組根據中獸醫理論及養殖生產實踐研制出補中益氣湯發酵制劑。為探討其對肉雞腸道環境和黏膜結構的影響,在飼料中添加不同劑量的補中益氣湯發酵制劑,測定腸道主要菌群數量、酶活性、pH 值及黏膜結構等指標的變化,為該制劑在生產實踐中應用提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品 補中益氣湯是由黃芪、黨參、白術、當歸、柴胡、升麻、陳皮、甘草等8 味中藥組成的。發酵方法參考張桂枝的文獻[11]。

1.2 試驗設計 1 日齡健康AA 肉雞,隔離飼養至7 日齡,選取300 只體重相近健康的肉仔雞,隨機分為4 組,每組設置5 個重復,每個重復15 只肉雞,自由采食和飲水,分籠飼養,試驗期間各組飼養管理條件完全一致。 空白對照組飼喂基礎日糧,中藥對照組在基礎日糧中按質量分數添加1%未發酵補中益氣湯中藥,試驗1、2 組在基礎日糧中按質量分數分別添加0.5%、1%補中益氣湯發酵制劑,混飼,連續添加。各組肉雞均在7 日齡1.5 倍量點眼滴鼻免疫接種新城疫活疫苗(LaSota株);21 日齡2.5 倍量飲水免疫接種新城疫活疫苗(LaSota 株)。

1.3 主要試劑 淀粉酶檢測試劑盒、蛋白酶檢測試劑盒、脂肪酶檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);新城疫活疫苗(LaSota 株)(購自齊魯動物保健品有限公司)。

1.4 主要儀器 生化培養箱、CO2培養箱、恒溫培養箱、酶標儀、奧林巴斯生物顯微鏡、pHS-3B 型酸度計、離心機、無菌操作臺、微型振蕩器、微量移液槍、高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.5 檢測指標及測定方法

1.5.1 腸道菌群數量的測定 在21、35 日齡時,每組隨機選取6 只健康肉雞,屠宰后,立即剖開腹部并截取回腸、盲腸各4 cm 左右,兩端用細繩結扎,用75%酒精消毒接扎口,裝進滅菌袋子里,-20 ℃冰箱保存。檢測時取待測腸段食糜,在超凈工作臺上稱取0.5 g 腸道食糜,放進提前滅菌過的試管內,加入滅菌生理鹽水4.5 mL 后,振蕩5 min,用滅菌紗布過濾,取0.5 mL 上清加入第二個試管中,按照上述步驟重復進行10 倍稀釋,然后取104~106倍稀釋液各50 μL 接種在麥康凱和LBS 培養基上,麥康凱培養基37 ℃生化培養箱培養24 h,LBS 培養基37 ℃CO2培養箱培養48 h,計數,求出每克食糜所含的細菌數,單位用(CFU/g)表示。

1.5.2 腸道酶活性的測定 在21 日齡和35 日齡,每組抽取6 只正常肉雞,屠宰后立刻取十二指腸、空腸和盲腸內容物4 g,迅速攪拌均勻,放入離心管置于-20 ℃的冰箱中保存。測定前,將樣品在冰上解凍,進行10 倍稀釋,混勻后放置在離心機3 500 r/min 離心10 min,取上清液,按試劑盒說明書測定脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶酶活性。

1.5.3 腸道pH 值的測定 在21、35 日齡,每組抽取6 只正常肉雞,屠宰后,迅速打開腹腔,取出十二指腸、空腸、回腸、盲腸的內容物各1 g 放置在離心管內,按照1 ∶8 的比例加入超純水(調節pH值7.0),振蕩混勻,用酸度計測pH 值。

1.5.4 腸道組織結構指標測定 分別在21、35 日齡時,每組隨機抽取6 只健康肉雞,屠宰后,打開腹腔,截取卵黃蒂后1 cm 位置回腸腸管3~4 cm,用裝有生理鹽水的注射器在不損壞腸絨毛結構的前提下,沖去腸道內容物,然后將腸道兩端結扎,并注入適量的10%甲醛磷酸緩沖液,然后放入緩沖液中固定4~6 h 后,剪去結扎的兩端,制作組織切片,觀察肉雞的腸道組織結構。選取測定樣本最厚腸壁厚度、最深隱窩深度和最長絨毛長度。

1.6 統計分析 試驗數據采用SPSS 20.0 統計軟件進行單因素方差分析,并用Duncan′s 法檢驗顯著性,以P<0.05 作為是否有差異顯著性的判斷標準;試驗數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道菌群數量的影響 由表1 可知,回腸與盲腸乳酸桿菌數量均有不同程度增加。試驗1、2 組回腸乳酸桿菌數量與空白對照組相比差異顯著(P<0.05),試驗2 組21 日齡及試驗1 組35 日齡盲腸乳酸桿菌數量與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。中藥對照組與空白對照組相比,乳酸桿菌數量沒有明顯差異(P>0.05);而在35 日齡回腸、盲腸乳酸桿菌數量與試驗1 組相比差異明顯(P<0.05),中藥對照組回腸乳酸桿菌數量與試驗2 組相比差異顯著(P<0.05)。在肉雞日糧中添加入不同劑量發酵中藥,大腸桿菌數量均有不同程度減少。21 日齡時,試驗2 組回腸與試驗1 組盲腸大腸桿菌數量與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。35 日齡時,試驗1、2 組回腸、盲腸中大腸桿菌數量與空白對照組相比明顯減少(P<0.05)。中藥對照組不同日齡回腸、盲腸大腸桿菌數量與空白對照組及試驗1、2 組相比,沒有明顯的差異(P>0.05)。

2.2 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道酶活性的影響 由表2 可知,在21 和35 日齡時,試驗1、2 組與空白對照組相比,淀粉酶和蛋白酶活性明顯升高(P<0.05),在21 日齡,試驗1 組淀粉酶活性明顯高于中藥對照組(P<0.05),中藥對照組淀粉酶活性明顯高于空白對照組(P<0.05)。35 日齡時,中藥對照組蛋白酶活性明顯高于空白對照組(P<0.05),與試驗1、2 組相比,淀粉酶與蛋白酶活性有顯著性差異(P<0.05)。

表1 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道菌群數量的影響 (CFU/g)

表2 日糧中添加復方中藥混菌發酵制劑對肉雞腸道酶活性的影響 (U/g)

2.3 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道pH 值的影響 由表3 可知,肉雞腸道pH 值各組均有不同程度的下降,十二指腸的pH 值下降不顯著,各組間無顯著差異(P>0.05)。 在21 日齡時,試驗2 組的空腸、回腸、盲腸pH 值下降最為明顯,與空白對照組相比差異顯著(P<0.05);在35日齡時,與空白對照組相比,試驗組1、2 組空腸、回腸、盲腸pH 值明顯降低(P<0.05),而中藥對照組只有回腸pH 值與空白對照組差異顯著(P<0.05)。

表3 日糧中添加復方中藥混菌發酵制劑對肉雞腸道pH 值的影響

2.4 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道組織結構的影響 從封二彩版圖1、圖2 可以看出,試驗1組和試驗2 組腸絨毛明顯變長,絨毛排列整齊、光滑,形態一致,單位面積上腸絨毛數量較多,而空白對照組和中藥對照組腸絨毛較寬,短而粗糙。

圖1 21 日齡肉雞回腸組織切片

圖2 35 日齡肉雞回腸組織切片

由表4 可知,21 日齡時,與空白對照組及中藥對照組相比較,試驗1、2 組的腸絨毛長度顯著變長,隱窩深度變淺,腸壁厚度變薄(P<0.05);中藥對照組與空白對照組相比較沒有明顯差異(P>0.05)。35 日齡時,與空白對照組及中藥對照組相比較,試驗1 的腸絨毛長度顯著增加,隱窩深度、腸壁厚度顯著降低(P<0.05);而試驗2 組只有腸絨毛長度差異顯著(P<0.05)。

表4 日糧中添加復方中藥混菌發酵制劑對肉雞腸道組織結構的影響 (μm)

3 討論

3.1 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道菌群數量的影響 腸道微生物菌群是消化系統的一個重要組成部分,乳酸桿菌和大腸桿菌常被作為研究畜禽腸道菌群的主要代表菌,其活菌含量與畜禽的健康密切相關[12]。董秀梅等研究表明,復方微生態制劑能使腸道中乳酸桿菌的數目明顯增多,并能明顯降低腸道內大腸桿菌的數目[13]。李樹鵬等研究表明,益生菌和黃芪多糖均能使腸道中的有益菌增殖,并阻抑有害菌的生長,兩者同時添加,作用增強[14]。本試驗結果表明,在日糧中添加補中益氣湯發酵制劑,回腸、盲腸乳酸桿菌的數目顯著增加,而大腸桿菌的數目明顯下降。而未發酵的補中益氣湯制劑雖有一定的促進乳酸桿菌增殖,抑制大腸桿菌繁殖的作用,但沒有發酵制劑明顯。因此,在日糧中添加一定劑量的補中益氣湯發酵制劑能夠調整肉雞腸道菌群,促進有益菌的增殖,抑制有害菌繁殖。

3.2 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道酶活性的影響 腸道消化酶來源于腸道微生物、機體分泌及外界攝入,是生物機體腸道內重要組成部分,參與腸道許多重要生物化學過程和物質循環,在機體營養物質消化吸收、免疫和生長發育等方面具有重要作用[15]。張利娟等研究發現,黃芪多糖和小檗堿的復合制劑能提高雞腸道淀粉酶和蛋白酶的活性[16]。王國霞等在蝦日糧中添加嗜酸性乳酸桿菌,發現能夠使蝦腸道內淀粉酶和蛋白酶的活性明顯增高[17]。Jin 等試驗表明,飼喂乳酸菌對肉雞小腸黏膜脂肪酶活性沒有明顯影響,能使淀粉酶的活性明顯增高[18]。但王志祥等在仔豬飼料里加入了乳酸桿菌,屠宰后仔豬十二指腸和胰腺內脂肪酶和淀粉酶的活性明顯的提高[19]。張曉梅等在雛雞日糧中添加地衣芽孢桿菌和乳酸桿菌等混菌發酵,結果發現能明顯提高雛雞腸道內脂肪酶和蛋白酶的活性[20]。前人研究發酵中藥對動物消化酶活性影響還鮮有報道。本試驗研究結果表明,日糧中添加補中益氣湯發酵制劑可以顯著提高腸道淀粉酶和蛋白酶活性,而對脂肪酶活性影響不明顯。未發酵補中益氣湯制劑也有相似的作用。說明補中益氣湯發酵制劑對促進動物胃腸道興奮和消化腺分泌消化酶及提高飼料利用率等具有重要作用。這可能與補中益氣湯發酵制劑能有效地促進小腸絨毛發育,增加消化吸收面積;調節腸道pH 值,為某些消化酶提供適宜的生化反應條件;調節腸道菌群,使腸道外源酶增加、促進內源酶分泌及酶基因表達水平增強等原因有關,從而使腸道酶活性提高。

3.3 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道pH 值的影響 腸道pH 值在動物對飼料養分消化、吸收和利用的過程中起著極其重要的作用,pH 值穩定是保證動物腸道各類消化酶完成生物催化,維持消化道菌群動態平衡的一個重要因素[21]。 目前,添加物對畜禽腸道pH 值影響的研究上主要集中在微生態制劑和酸化劑上,多數研究表明,添加物可顯著降低腸道pH 值[22-23];中藥對腸道pH值的影響研究較少,多沒有明顯作用效果[21,24];關于發酵中藥對腸道pH 值的影響還鮮有報道。本試驗結果表明,補中益氣湯發酵制劑能使肉雞空腸、回腸和盲腸pH 值顯著下降。腸道環境酸化,提高腸道酶活性,有利于日糧中營養物質的消化吸收,有利于有益菌群的繁殖。

3.4 補中益氣湯發酵制劑對肉雞腸道組織結構的影響 動物小腸黏膜絨毛高度、隱窩深度和腸壁厚度是評判腸道消化能力的重要指標[25]。張金龍等研究結果表明,在飼料中添加2%發酵桑葉粉可顯著提升肉雞腸絨毛高度,增加了腸道隱窩深度[26]。邢亞麗等研究表明,在日糧中添加0.1%和0.2%樹舌發酵浸膏多糖可顯著增加肉雞腸絨毛高度,降低隱窩深度,提高腸絨毛高度和隱窩深度的比值[27]。本試驗結果表明,補中益氣湯發酵制劑可顯著地增加肉雞腸絨毛長度,降低隱窩深度和腸壁厚度。說明補中益氣湯發酵制劑可明顯促進小腸黏膜絨毛的生長發育,改善消化道黏膜形態與結構,進而增加肉雞消化吸收能力。

4 結論

在肉雞飼料中添加補中益氣湯發酵制劑,能調節腸道菌群組成,增加腸道內源酶活性,調節腸道pH 值,改善腸道形態結構。