豬源枯草芽孢桿菌的分離鑒定及其生物特性研究

袁 林,涂熠坤,2,曾 靜,郭建軍

(1.江西省科學院微生物研究所,江西 南昌330096;2.南京工業大學化學與分子工程學院,江蘇 南京210000)

含有益生菌的微生態制劑能夠改善因長期使用抗生素藥物所帶來的副作用,微生態制劑由于具有無藥物殘留、無毒副作用、細菌不產生耐藥性等特點[1],且可以調節腸道微生態環境,防治動物腸道疾病,提高動物的抗病能力和生產性能[2],因此,在養殖行業具有廣闊的應用前景。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)是我國農業部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一,因具有改善消化道內環境、促進動物生長、提高動物機體免疫力及產生多種酶類、提高消化酶活性等功能[3],故具有廣闊的發展前景,并在飼料添加劑、生物農藥、污水處理、疫苗載體等[4]各方面已經得到了廣泛的應用。

枯草芽孢桿菌是一類好氧產芽孢的革蘭陽性桿狀細菌,無莢膜,有鞭毛,能運動,廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動植物的體表,無致病性[5]。由于枯草芽孢桿菌具有生長速度快、營養簡單以及耐熱、可產抗逆芽孢等突出特征,在微生態制劑生產加工等環境中的易存活、定殖與繁殖,成本較低,施用方便,儲存期長[6],現作為一種無毒、無害、無殘留、無抗藥性的綠色飼料添加劑重要菌種之一。但目前市場上大多數商品化的作為豬飼料添加劑的枯草芽孢桿菌都是從泥土和草地等自然環境中分離出來的,要想篩選出作為豬的飼料添加劑理想的菌種,應優選來源于豬腸道,經過與豬共生長期馴化的枯草芽孢桿菌,才能夠更好地適應豬體內環境、發揮更好的效果[7]。

本試驗對從健康豬腸道內容物、新鮮糞便及豬場周邊土壤中芽孢桿菌,進行菌落形態觀察、生理生化特征和16S rRNA 序列分析及同源性比較,研究了其生物學特性,以期得到高生物活性的益生菌菌株,為豬微生態飼料添加劑的開發提供候選菌株。

1 材料

1.1 樣品來源 采自江西贛州、上饒等地豬場健康豬腸道內容物、新鮮糞便及豬場周邊土壤。

1.2 培養基 富集培養基(液體):可溶性淀粉3.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母膏3.0 g,磷酸氫二鈉2.0 g,磷酸氫二鉀1.5 g,硫酸鎂0.1 g,去離子水1 000 mL,pH 值7.5,121 ℃滅菌20 min。

分離培養基(固體):葡萄糖5.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母膏5.0 g,磷酸氫二鉀4.0 g,瓊脂粉18.0 g,去離子水1 000 mL,pH 值7.4,121 ℃滅菌20 min。

LB 培養基:氯化鈉10.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,去離子水1 000 mL,pH 值7.5,121 ℃滅菌20 min。

2 方法

2.1 菌株的分離與篩選 菌株的初篩:取新鮮仔豬糞25 g,與225 mL 富集培養基于三角瓶中混合均勻,30 ℃搖床培養過夜,將培養好的菌懸液置于80 ℃水浴鍋中處理15 min,然后取出靜置冷卻,吸取已經進行熱處理的培養液1 mL,用滅菌0.9%生理鹽水進行梯度稀釋至10-5、10-6、10-7三個濃度梯度,每個梯度重復3 次,通過平板涂布法接種于分離培養基上,于30 ℃溫箱培養24~48 h。挑取圓形、表面平整、不光滑、無光澤、邊緣不整齊的菌落進行擴增培養,培養好后取少量菌液進行革蘭染色及芽孢染色觀察[8],對疑似菌落進行分離純化,并將分離純化好的菌株于-70 ℃冰箱保存備用。

菌株的復篩:將初步分離的疑似芽孢桿菌的單菌落分別點種到淀粉酶篩選培養基、CMC-Na 纖維素酶篩選培養基和干酪素培養基上[9],30 ℃下培養48 h,(1)在干酪素培養基上的菌落周圍產生透明的水解圈則表明該菌株具有產蛋白酶能力;(2)在淀粉酶篩選培養基上滴加盧戈氏碘液,觀察是否有水解環出現,若菌落周圍產生透明水解圈則表明該菌株具有產淀粉酶能力;(3)在CMC-Na 纖維素酶篩選培養基上滴加剛果紅水溶液,靜置顯色30 min 后用蒸餾水洗去多余染液,再加入適量NaCl 溶液靜置洗脫30 min,最后再用蒸餾水清洗一次。若產生水解圈則表明該菌株具有產CMC 纖維素酶能力。每株菌株進行至少3 次生物學重復,通過比較測量的水解圈直徑大小(HD)和菌落直徑大小(CD)的比值(HD/CD)大小,篩選出具有較強產酶能力的菌株[10]。

2.2 菌株的特征鑒定 形態和生理生化特征鑒定:上述分離純化方法獲取疑似芽孢桿菌菌株按常規細菌生化試驗,根據革蘭染色后菌株形態學的特性,初步選取形態學特征較為明顯的菌株(革蘭陽性、棒狀或短桿狀、有內生芽孢)進行生化特征分析[11]。參考《伯杰式細菌鑒定手冊》第八版進行鑒定,選擇接觸酶、糖/醇利用、V-P 反應、淀粉水解、吲哚形成、明膠液化、纖維素水解、蛋白水解、硝酸鹽、檸檬酸鹽和硫化氫利用試驗作為初步判斷枯草芽孢桿菌的特征性生化指標[9-10]。

菌株分子生物學鑒定:使用細菌基因組DNA 提取試劑盒(AXYGEN 公司),參考試劑盒說明書進行細菌基因組DNA 的提取。16S rRNA 基因保守序列使用通用引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′和27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′進行PCR擴增。25 μL 反應體系:10×Buffer 2.5 μL、模版DNA 1 μL,上下游引物各1 μL,dNTP 2 μL,Taq DNA 聚合酶0.5 μL,加無菌水至25 μL。PCR 條件為94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35 個循環。將16S rRNA 擴增片段經過1%瓊脂糖凝膠電泳后,紫外燈下觀察,并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(AXYGEN 公司)對目的片段進行回收,對回收后的產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果在NCBI 使用Blast 比對,從GenBank 數據庫中獲得與菌株16S rDNA 源的公認標準序列數據,使用Clustal X 1.8 將不同的序列對齊后,使用DNAman 5.1 構建菌株的系統進化樹。

2.3 菌株的生物學特性 耐酸試驗:取1 mL 菌株培養液加入pH 值3.0 的50 mL 營養肉湯培養基中,37 ℃,120 r/min 搖床培養,于0 h、3 h、6 h 和9 h進行平板計數,計算存活率,設3 個重復。

耐膽鹽試驗:取1 mL 菌株培養液加入膽鹽濃度為0.5%50 mL 的營養肉湯培養基培養,于0 h、4 h 和8 h 進行平板計數,計算存活率,設3 個重復。

產酶能力:淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法測定,蛋白酶活性采用福林酚法測定[12],纖維素酶活性采用羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)酶活性測定方法測定[13],脂肪酶活性采用橄欖油乳化液法測定[14]。

3 結果

3.1 細菌的篩選分離 從健康豬腸道內容物、新鮮豬糞便及豬場周邊土壤等樣品中分離純化得到的菌株進行革蘭染色,選取革蘭陽性菌和有芽孢的菌落再做生化鑒定試驗進一步驗證,參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰式細菌鑒定手冊》,篩選接觸酶、V-P 反應、明膠水解、葡萄糖產酸和硝酸鹽利用為陽性的菌株,初步確定了11 株疑似芽孢桿菌,分別 為GZ-0107、GZ-0183、FU-037、SR-096、MR-0302、GT-067、GT-082、GT-0126、GT-53、GT-0213 和WI-074,其結果見表1。

表1 菌株的生化鑒定結果

將初篩獲得疑似芽孢桿菌分別點種于淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶篩選培養基上,培養48 h 后,測量不同篩選平板上單菌落的直徑(CD)和水解圈或透明圈的直徑(HD),通過比較HD/CD 的比值來判斷不同菌株產酶能力的大小。從表2 可以看出,能夠同時表現出淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的菌株共有8 株,MR-0302 只表現出淀粉酶酶活,GT-0126 和GT-0159 沒有表現出纖維素酶活,而GZ-0107、GZ-0183 和SR-096 這3 株菌具有較為明顯的高產淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的綜合能力,尤其是SR-096菌株,其綜合產酶能力最為突出。

根據上述生化特征分析及產酶能力分析結果(見表1 和表2),選取8 株菌株,即GZ-0107、GZ-0183、FU-037、SR-096、GT-067、GT-082、GT-0213 和WI-074,16S rRNA 基因測序結果呈送GenBank 數據庫中收錄,收錄號分別為KP834902、KP834901、KP834904、 KP996671、 KP834899、 KP834898、KP834895 和KP834900。以16S rRNA 基因BLAST進行序列同源比對及系統發育樹,如圖1 所示,結果表明,FU-037 和WI-074 位于臘樣芽孢桿菌大分支中,FU-037 與蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)KJ722447 的相似性為 99.2%,WI-074 與蠟樣芽孢桿菌FJ210679 的相似性為99.1%;GZ-0107、GZ-0183、SR-096、GT-067、GT-082 和GT-0159 位于枯草芽孢桿菌大分支中,其中GZ-0183 與枯草芽孢桿菌KJ957013 的相似性達到99.6%。綜合生化特征和分子鑒定結果,認為FU-037、GT-0213 和WI-074 為臘樣芽孢桿菌,GZ-0107、GZ-0183、SR-096、GT-067和GT-082 為枯草芽孢桿菌。

表2 芽孢桿菌產酶能力測定結果

圖1 芽孢桿菌的16S rRNA 基因系統發育樹

3.2 菌株生物學特性分析

3.2.1 耐酸耐膽鹽試驗 從圖2 可看出,不同菌株間耐酸性存在較大差異,pH 值3.0 的環境下處理3 h 后GZ-0107、GZ-0183、SR-096 和的存活率分別為58.7%、77.2%、89.2%:處理6 h 后分別為41.7%、38.4%、82.5%;處理9 h 過程中,GZ-0107 存活率下降最明顯,SR-096 存活率仍在70%以上,耐酸能力明顯優于另外兩株菌。

由圖3 結果可知,在高濃度膽鹽處理2 h 后GZ-0183 的存活率為51.9%;處理8 h 后SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 的存活率分別為46.7%、14.7%、19.8%。SR-096 在高濃度膽鹽處理后仍有以上的存活率,具有較強的耐膽鹽能力。

圖2 不同菌株間的耐酸性比較

圖3 不同菌株間的耐膽鹽比較

3.2.2 產酶試驗結果 由表2 可以看出,菌株SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 都可產淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶,不同菌株產酶種類和能力不同。對于3株枯草芽孢桿菌,蛋白質水解環直徑橫向比較差異不顯著,但在在培養28 h 后,SR-096 蛋白質水解環直徑都顯著大于GZ-0107,GZ-0183(P<0.05);反映其產淀粉酶能力的染色圈直徑/菌落直徑(HD/CD)上發現SR-096 和GZ-0183 的水解環直徑顯著大于GZ-0107(P<0.05);反映其產纖維素酶能力的(HD/CD)及產脂肪酶能力的(HD/CD)數值上均為SR-096 最高,但菌株之間差異不明顯,說明菌株SR-096 具有較好的產淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶能力水平。因發現平板法HD/CD不能完全代表菌株產酶能力,所以對產酶菌株進行發酵液法胞外酶產酶活性測定是非常必要的。由表3 可以看出,菌株SR-096 產蛋白酶和淀粉酶活力顯著高于菌株GZ-0107 和GZ-0183、在纖維素酶和脂肪酶活力只是在數值上較高,與初篩結果基本一致。

表3 不同菌株發酵液的胞外酶活性 (U/mL)

4 討論

微生態制劑在生產過程中一般把篩選益生菌作為關鍵的一步,因為種屬特異性是篩選合適益生菌的一個先決條件,不同來源的芽孢桿菌在不同動物胃腸道內的粘附繁殖能力及相關生理功能有所不同[15]。本試驗菌株是從豬腸道內容物、糞便、土壤等中分離純化,先通過傳統方法對分離出來的菌株做菌落形態觀察、染色鏡檢和生理生化檢測,然后運用16S rDNA 核酸序列分析及同源性比較進行菌株鑒定,這樣可以最大程度地保證結果的準確性和客觀性。試驗中分離出在菌落形態和生理生化特性與標準枯草芽孢桿菌基本吻合的疑似菌株11株,其中8 株能夠同時表現出產淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶能力;16S rRNA 核酸全序列測序和同源性比對分析發現有5 株與枯草芽孢桿菌的同源性最高,達到99%以上。經細菌的菌落形態觀察、染色鏡檢、生化試驗以及16S rRNA 序列分析及同源性比較,綜合確定菌株SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌作為益生菌,因枯草芽桿菌在缺乏營養或不良環境時,通過生成內生孢子來增強抵抗腸道逆境條件,而表現出耐胃酸、耐膽鹽、耐加工、耐儲藏、穩定性等特性,還具有分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力[16]。這些外源性的消化酶,參與動物消化道的酶池,在一定程度上幫助降解動植物性飼料中復雜的有機物,促進營養物質的消化吸收,提高飼料利用率。因此,芽孢桿菌作為益生菌制劑開發應用的潛力很大。本試驗采用平板透明圈法結合胞外酶活性測定,對枯草芽孢桿菌產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶情況進行分析,初步反映出產酶活力的高低,產酶能力越高,水解圈越大;產酶速度越快,水解圈出現的越早。培養液法胞外酶產酶活性與平板透明圈法反應的酶活基本一致。其中枯草芽孢桿菌SR-096 產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶能力的表現較為顯著,具有較高的綜合產酶能力,其可以在畜牧養殖中用來高效轉化飼料中的淀粉、蛋白質和纖維素,這為今后將其應用于生產實踐提供了重要的理論依據。