非洲豬瘟病毒K196 R 基因實時熒光定量PCR 檢測方法的建立

崔貝貝,仇松寅,梅 琳,韓雪清,吳紹強,李 霆,林祥梅

(中國檢驗檢疫科學研究院,北京 大興100176)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起,是家豬和野豬的一種高度接觸性、致死性傳染病[1]。ASFV是非洲豬瘟病毒科中的唯一成員,只有一個血清型,有24 個基因型[2]。病毒粒子的直徑是175~215 nm,呈20 面體對稱,基因組為雙股線狀DNA,大小為170~190 kb,基因組含有160~175 個開放閱讀框(ORF),編碼150~200 種蛋白質[3,4]。ASFV病毒粒子的基因組大,基因易變異,病毒編碼的蛋白種類繁多,病毒存活力強,可通過多種途徑和方式進行有效傳播,這是導致ASFV 在染疫國家和地區呈地方性流行的重要原因之一。2018 年8 月3日我國發生首起非洲豬瘟疫情[5],此后3 個多月內,已有18 個省份累計暴發69 起[6],給我國養豬業造成了沉重打擊。從目前ASF 全球流行態勢及世界各國的防控經驗來看,我國面臨的形勢異常嚴峻,ASF 的消除和凈化工作已經被提到日程,ASF 診斷技術研究與應用對我國ASF 的防控和根除顯得尤為重要。

常用于檢測ASF 的實驗室診斷方法有酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、直接/間接免疫熒光、血細胞吸附反應(Hemadsorption,HAD)、環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、普通PCR 和熒光定量PCR 等。由于ASF 通常導致豬只迅速死亡,目前ASF 的實驗室診斷以檢測核酸為主。而PCR 法,尤其是實時熒光定量PCR 具有靈敏度高、污染率低、適用樣品類型多的優點,近年來在各個領域特別是在基因檢測方面被廣為應用[7]。世界動物衛生組織(OIE)推薦的TaqMan實時熒光定量PCR,檢測方法準確度高,但僅以表達結構蛋白P72 的B646L 基因為靶標,相對單一,故開發新型的ASFV 早期基因診斷靶標有助于盡早確定疫情。經序列比對分析,ASFV K196R 基因序列高度保守。據文獻報道K196R 基因在病毒感染早期就可以在感染動物的血液中檢測到[8],且K196R 基因的編碼產物也是非洲豬瘟病毒的一種免疫顯著抗原[9],但以ASFV K196R 基因作為靶基因進行熒光定量PCR 檢測ASFV,至今鮮有報道。基于此,本研究以K196R 基因作為非洲豬瘟病毒早期檢測靶基因,選取基因組保守區域設計引物和探針,建立了TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法,以期為開發新型ASFV 檢測試劑盒提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 偽狂犬病活疫苗(Kartha-K61株),購自齊魯動物保健品有限公司;豬細小病毒病滅活疫苗(WH-1),購自中牧實業股份有限公司;豬圓環病毒2 型滅活疫苗(LG 株),購自獸藥集團生物疫苗有限公司;整合K196R 基因的細胞系由中國檢驗檢疫科學研究院動檢所建立并保存。QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Cat No.208052)、QuantiNova Probe PCR Kit(Cat No.208254)、DNeasy Blood&Tissue Kit(Cat No.69506)以及jetPRIME DNA&siRNA Transfection Reagent 等試劑,均購自北京宏捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設計 參考GenBank 中公布的格魯吉亞豬ASFV K196R 基因核苷酸序列(FR682468.1),設計了1 對特異性引物和1 條探針,如表1 所示。引物和探針均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 K196R 基因的引物、探針序列

1.2.2 病毒基因組DNA 的提取 按照病毒基因組DNA 提取試劑盒(Cat No.69506)操作說明書,提取偽狂犬病活疫苗(Kartha-K61 株)、豬細小病毒病滅活疫苗(WH-1)和豬圓環病毒2 型滅活疫苗(LG株)的全基因組DNA。

1.2.3 實時熒光定量PCR 分析系統的建立

1.2.3.1 PCR 反應體系條件優化 按照QuantiNova Probe PCR 試劑盒說明書提供的反應體系(表2),將退火溫度分別設置為56 ℃、58 ℃、59 ℃、59.5 ℃、60 ℃、60.5 ℃、61 ℃、62 ℃、64 ℃,9 個溫度梯度,優化退火溫度。引物濃度從200、300、400、500、600 nmol/L,探針濃 度從50、100、200、300、400 nmol/L,分別稀釋5 個濃度梯度,以最佳的退火溫度分別優化引物和探針濃度。選取最低的Ct值和最高的ΔR(熒光強度增加值),如果Ct 值和ΔR 不一致時,則優先考慮Ct 值。循環條件為:預變性95 ℃、2 min;以95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,擴增40 個循環。擴增結束后,驗證反應體系及其引物的特異性。1.2.3.2 標準曲線的建立 陽性克隆質粒pUC57-ASFV-K196R 由北京六合華大基因科技股份有限公司合成并測序,測序無誤后,采用全自動酶標儀測定質粒的濃度和純度。參照文獻[10]介紹的質粒拷貝數公式,計算出每微升標準品中所含的拷貝數。對陽性重組質粒進行10 倍的倍比稀釋,得到100~108copies/μL 等9 個稀釋度的重組質粒作為標準品模板,按照1.2.3.1 優化的方法,進行TaqMan 實時熒光定量PCR 擴增,繪制標準曲線。

表2 實時熒光定量PCR 反應體系

1.2.3.3 靈敏性試驗 以重組質粒pUC57-ASFVK196R 為標準陽性質粒,分別做10 倍的倍比稀釋,每個模板濃度作3 個平行樣。根據已經建立的TaqMan 實時熒光定量PCR 的反應體系和反應參數進行相應的PCR 擴增,通過觀察擴增曲線來確定檢測到重組質粒的最低拷貝數,并最終以Ct 值為縱坐標,兩種基因拷貝數為橫坐標,建立標準曲線,對整個PCR 體系的靈敏性進行評價。

1.2.3.4 實時熒光定量PCR 方法的特異性檢測 采用TaqMan 實時熒光定量PCR 反應體系,以pUC57-ASFV-K196R 的重組質粒DNA 作為標準的陽性對照。 偽狂犬病病毒、豬圓環病毒2型、豬細小病毒基因組DNA 作為其他毒株模板,無菌水作為陰性對照;使用ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀進行擴增,以驗證所建立診斷方法的特異性。

1.2.3.5 細胞系的篩選與鑒定 用針對K196R 基因設計的特異性引物,以重組質粒pUC57-ASFVK196R DNA 為模板,擴增出K196R 特異性片段,與pcDNA4-Flag 載體連接,經酶切鑒定與測序正確后,按照jetPRIME?DNA&siRNA 轉染試劑說明書,將構建的pcDNA4-Flag-K196R 質粒轉入提前準備好的PK-15 細胞中。24 h 后,分別按照1×105個/mL,2×105個/mL,4×105個/mL,6×105個/mL 的細胞濃度,將細胞重新鋪在20 mm ×100 mm 的細胞培養皿中,每個平皿中加入終濃度為30 ng/mL 的Zeocine。待培養皿中長出單克隆后,取單克隆細胞株做Western Blotting 鑒定,將flag 標簽抗體陽性且穩定表達分子量在23 kDa 的K196R 細胞株擴大培養并凍存。

2 結果與分析

2.1 序列比對 從GenBank 數據庫中下載28 條ASFV 代表性毒株的全基因組序列,利用DNAStar軟件對序列進行比對與分析,發現K196R 基因序列高度保守,序列比對結果如圖1 所示。

2.2 ASFV 實時熒光定量PCR 分析系統的優化與建立

2.2.1 ASFV K196R 基因實時熒光定量PCR 熔解曲線 pUC57-ASFV-K196R 陽性重組質粒按照QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Cat No.208052)說明書進行擴增,結果顯示,K196R 基因的熔解曲線在Tm 值為77.79 處有單一峰,可知引物無非特異性擴增。

2.2.2 ASFV K196R 基因實時熒光定量PCR 退火溫度的優化 通過分析K196R 基因引物對的Tm值,分別選取56 ℃、58 ℃、59 ℃、59.5 ℃、60 ℃、60.5 ℃、61 ℃、62 ℃、64 ℃,9 個不同的退火溫度進行TaqMan 實時熒光定量PCR 擴增,通過對不同退火溫度擴增曲線的Ct 值進行比較,結果顯示,60 ℃時的Ct 值為17.448,是9 個不同退火溫度擴增結果中的最小值,因此退火溫度為60 ℃時pUC57-ASFVK196R 陽性重組質粒的擴增效率最高。 如表3所示。

表3 ASFV K196R 基因不同Tm 值擴增曲線的Ct 值

2.2.3 ASFV K196R 基因的引物濃度優化 通過對200、300、400、500、600 nM 等5 個不同濃度的上下游引物按照QuantiNova Probe PCR 試劑盒說明書提供的反應體系進行擴增,擴增結束后分別統計擴增曲線的Ct 值和ΔR 值,得到在上下游引物濃度為0.4 μM 時pUC57-ASFV-K196R 陽性重組質粒的擴增效率最高。所以上下游引物的最佳濃度為0.4 μM。如圖2 所示。

2.2.4 ASFV K196R 基因的探針濃度優化 探針濃度按照50、100、200、300、400 nM,稀釋5 個濃度梯度。根據QuantiNova Probe PCR 試劑盒說明書提供的反應體系,以優化好的引物濃度和Tm 值,在ABI 7500 儀器上擴增,得到如圖3 所示的擴增曲線。依據最低的Ct 值和最高的ΔR 值,ASFV K196R 基因探針的最佳濃度為0.2 μM。

圖2 ASFV K196R 基因引物濃度優化

圖3 ASFV K196R 基因探針濃度優化

2.3 ASFV 實時熒光定量PCR 方法檢測質粒樣品的靈敏性 選擇1.2.3.2 中測序比對結果為陽性的質粒,經質粒提取,通過紫外分光光度計測定pUC57-ASFV-K196R 重組質粒濃度,為47.05 ng/μL,純度為1.897。參照1.2.3.2 拷貝數計算公式換算pUC57-ASFV-K196R 病毒模板拷貝數為1.3×10 10 copies/μL,依次按10 的倍數倍比稀釋,取1.3×108~1.3×100copies/μL,依照優化后的反應體系及條件,進行靈敏度檢驗。結果顯示,該基因的擴增曲線呈現典型的S 型,各曲線間距均勻。基于K196R 基因的實時熒光定量PCR 方法最低檢測量是1.3 個拷貝(圖4);而基于 K196R 基因的方法擴增效率是101.59%,回歸方程為Y=-3.284X+37.466,R2=0.998(圖5)。

2.4 ASFV 實時熒光定量PCR 方法的特異性檢測對偽狂犬病病毒、豬圓環病毒2 型以及豬細小病毒的全基因組DNA 和pUC57-ASFV-K196R 陽性重組質粒同時進行檢測,結果表明,只有pUC57-ASFVK196R 陽性重組質粒可產生特異性熒光曲線,其余皆為陰性,證明該方法中設計的引物和探針均有著較強的特異性(圖6)。

2.5 實時熒光定量PCR 方法對模擬臨床樣品的檢測 對1.2.3.5 方法中建立的整合K196R 基因的細胞系,采用優化后的反應體系及條件,進行實時熒光定量PCR 擴增。如圖7 所示擴增曲線,0.52×104copies/μL 的pUC57-ASFV-K196R 陽性重組質粒和整合K196R 基因的細胞系,均可檢測到較強的熒光信號。

圖4 ASFV K196R 基因擴增曲線

圖5 ASFV K196R 基因標準曲線

表4 陽性對照質粒不同拷貝數的Ct 值

圖6 不同病毒ASFV K196R 基因的擴增曲線

圖7 ASFV K196R 細胞系擴增曲線

3 討論

ASFV 基因型多,易變異,目前無有效疫苗預防,因此防控ASFV 主要靠監測和滅源。 國內外已建立的多種檢測ASFV 方法中,HAD 試驗對高效價的ASFV 可在24 h 內得到準確的檢測結果,但對于一個陰性結果的判定至少需要6 d的時間,且某些低毒力ASFV 的檢測,結果往往呈陰性[11-12],不適用于快速檢測。 ELISA 方法檢測ASFV 抗原,雖具備快速、準確的特點,但對于亞急性和慢性感染豬體內低的ASFV 載量樣本,檢測敏感性低,易出現假陰性結果[13]。此外,OIE 規定,涉及ASFV 活毒的HAD、ELISA等試驗操作應在生物安全三級實驗室條件下進行,實時熒光定量PCR 方法對滅活樣品僅需在生物安全二級實驗室條件下即可進行,特別適用于急性感染早期動物組織樣本、急性感染恢復期、低毒力或中等毒力感染家豬以及持續性感染的野豬和軟蜱組織樣本中ASFV 核酸的檢測[14]。

本研究比對了不同ASFV 毒株的K196R 基因序列,依據最保守的區域設計引物和探針,建立了ASFV TaqMan 實時熒光定量PCR 方法,通用性好;且建立的標準曲線線性關系良好(R2=0.998),敏感性高,最低能檢測到1.3 個拷貝/μL 的病毒核酸分子DNA。而2012 年,李洪利等檢測ASFV B646L 基因,最低能夠檢測到10 拷貝/μL 的質粒[15];2009 年,董志珍等根據E183L基因的核苷酸序列建立了ASFV 檢測的熒光定量PCR 方法,也僅檢出15 個拷貝/μL 的樣品[16]。此外,利用本方法分別對PRV、PCV2 以及PPV等病毒的全基因組進行特異性檢測,發現該方法對其他豬病毒基因組DNA 均不能產生特異性擴增,說明該方法具有很好的反應特異性。為模擬臨床樣品檢測,本研究建立了穩定表達K196R 蛋白的細胞系,利用建立的TaqMan 實時熒光定量PCR 方法檢測該細胞系基因組,結果呈典型的S 曲線,為該方法的臨床應用提供了實驗依據。

本研究以ASFV K196R 基因為靶標,建立的TaqMan 實時熒光定量PCR 方法,特異性強,靈敏度高,對檢測樣品和環境要求相對較低,適合大批量樣品的檢測,對今后ASFV 檢測試劑盒的開發具有重要的指導意義。