熒光定量PCR對FEN1敲低細胞株轉錄組測序結果的驗證*

蘇 倩，吳 潔，杜佳慧，楊 凡，袁濮玉，劉松柏，邱秀芹

(蘇州衛生職業技術學院蘇州檢驗醫學生物技術重點實驗室，蘇州 215009)

DNA分枝結構特異性內切酶-1(flap endonuclease 1，FEN1)作為一個結構特異性核酸酶，除在DNA復制中起著至關重要的作用外，在DNA損傷修復過程中也起著重要作用[1-4]。目前闡述得較清楚的是在堿基錯配修復(base excision repair，BER)及Pol α合成錯配修復通路(α-segment error editing，AEE)中的功能[1-5]。前期研究結果顯示，FEN1純合敲除小鼠胚胎致死，說明FEN1功能的重要性[6]。為研究FEN1在細胞代謝過程中的具體功能，研究人員往往采用轉染外源FEN1表達質粒或干擾RNA進入細胞，通過升高或降低FEN1表達的方式研究FEN1在不同條件下的具體功能[7-9]。

轉錄組測序技術又稱RNA測序(RNA-sequencing，RNA-Seq)，是指利用高通量測序技術，快速全方位地獲取在某一條件下某一物種特定組織及器官幾乎全部轉錄本，目前廣泛應用于針對不同條件下細胞內基因表達水平差異的檢測，從而研究條件改變引起基因表達改變的群簇，為從分子機制上闡明細胞表型改變的內在驅動力提供依據[10]。熒光定量PCR技術自開發應用以來，因為靈敏、準確、高效、特異等特點一直被作為對特定組織細胞中特定基因數量進行定量的金標準，同時經常被用來驗證轉錄組測序的結果[11]。為全面研究FEN1在細胞中的具體功能，本研究從前期FEN1基因敲低細胞株及對照細胞株的轉錄組測序結果中篩選若干個差異表達的基因，設計引物，利用熒光定量PCR技術進行結果驗證，為進一步具體分析研究轉錄組測序數據奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人腎上皮細胞系293T細胞和本實驗構建的FEN1敲低細胞SG67。

1.1.2主要儀器與試劑 DMEM(高糖)培養基、胎牛血清、胰酶均購自美國HyClone公司；RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；FEN1鼠源一抗、羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自美國Genetex公司；反轉錄試劑盒購自日本TakaRa公司；SYBR Green熒光定量PCR試劑購自瑞士羅氏公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司進行合成。ABI Step One Plus 實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 293T細胞和SG67細胞常規復蘇后，接種于50 mL培養瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養液，于37 ℃ 5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。80%細胞融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2總RNA的提取 取對數生長期細胞，棄培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，用PBS吹細胞，收到1.5 mL EP管中，3 000 r/min離心1 min，棄上清液，置于-80 ℃冰箱中或者立即實驗。加入適量的Trizol試劑，使細胞充分裂解；室溫靜置5 min后，轉移到1.5 mL離心管中；振蕩器劇烈混勻15 s，室溫放置3 min；再在4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min；提取上清液，在裝有上清液的EP管中加入等體積異丙醇溶液，充分混勻，室溫靜置15～20 min；在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，離心后管底絮狀沉淀即為RNA。用無RNase水溶解稀釋RNA樣品，紫外吸收法測定總RNA的濃度及純度，樣品RNA 260 nm與280 nm處吸光度(A)值比值(A260/A280)為1.8～2.1之間。變性瓊脂糖凝膠電泳評估總RNA的完整性。

1.2.3反轉錄合成cDNA 根據反轉錄試劑盒說明先配制10 μL體系：Oligo dT 2 μL、dNTP 2 μL、RNA 4 μL、無RNase雙蒸水(ddH2O)12 μL。65 ℃，5 min，冰上急冷2 min；取上述溶液20 μL，加入5×primer script buffer 8 μL、RNase inhibifor 1 μL、Primer script 2 μL、無RNase ddH2O 9 μL，配成總體系40 μL。PCR儀上設計程序：30 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，70 ℃ 15 min，4 ℃ 10 min。所得溶液置于-20 ℃保存。

1.2.4熒光定量 PCR 表達驗證

1.2.4.1轉錄組測序 通過Ⅰllumina Hiseq 2500高通量測序平臺測序，在RNA序列分析中，可將定位到基因組區域的序列數量作為計算基因的表達水平。為了解293T(Ctrl)和293T的FEN1敲低細胞(FEN1KD)中基因表達差異情況，本研究采用RSEM軟件計算基因表達水平，衡量基因表達水平的標準為FPKM值。在構建cDNA文庫時，FPKM值將隨機打斷的片段作為分析單位，并把FPKM值作為基因在細胞中的表達水平。3次獨立重復實驗，根據轉錄組測序結果找出差異表達的基因。

1.2.4.2引物設計 根據高通量測序結果，篩選出10個預測有表達差異基因序列，利用 Primer premier5.0軟件進行引物設計，并經上海生工生物工程有限公司進行合成。通過常規PCR反應對目的片段進行擴增，并摸索反應最適條件。具體實驗過程根據Takara PCR試劑盒的說明書進行操作。引物信息見表1。

表1 PCR引物信息

1.2.4.3熒光定量PCR 采用SYBR Green Ⅰ法進行熒光定量PCR，驗證轉錄組測序結果的準確性。以反轉錄產物cDNA為模板，嚴格按照羅氏熒光定量反應試劑盒說明書進行實驗操作。每個模板設置3個復孔，每個基因設置3個陰性對照，總反應體系為20 μL，反應條件：95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。獨立3次重復實驗。熒光定量PCR擴增挑選基因所用引物與表1引物序列相同。

2 結 果

2.1FEN1敲低細胞系驗證 通過蛋白質印跡法(Western blot)檢測293T細胞和SG67細胞表達FEN1蛋白情況，結果顯示與對照293T細胞相比，SG67細胞的FEN1蛋白表達水平明顯下降，見圖1。

M:蛋白標記物

圖1 FEN1敲低細胞株SG67的FEN1蛋白表達

2.2轉錄組結果與分析 通過Ⅰllumina Hiseq 2500高通量測序平臺對293T(Ctrl)和293T的 FEN1敲低細胞(FEN1KD)進行轉錄組測序，并從轉錄組測序結果中篩選出10個差異表達的基因，其表達水平見表2。

表2 轉錄組測序預測的基因表達水平

續表2 轉錄組測序預測的基因表達水平

2.3篩選基因PCR擴增結果 選取293T細胞的cDNA經普通PCR擴增10個基因，程序設定：95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，LC7A3、MAGEB2、HBE1、SLC6A11、ITPKB、SPINT和EVA1C等7個基因都有表達，且條帶單一，見圖2。

M：DL 2000；1：SLC7A3；2：MAGEB2；3：HBE1；4：SLC6A11；5：ITPKB；6：SPINT1；7：EVA1C

圖2 293T細胞中差異表達基因的PCR產物電泳圖

2.4篩選基因熒光定量檢測結果 根據轉錄組測序及普通PCR結果，選取在兩種細胞中差異表達并經普通PCR擴增的條帶單一的7個基因，通過熒光定量PCR檢測這7個基因分別在293T和SG67細胞中的表達情況，每個基因的擴增進行了3次實驗重復。熒光定量PCR結果顯示與轉錄組測序結果基本一致。利用定量PCR檢測方法發現ITPKB與EVA1C基因在兩種細胞株中表達雖然有差異，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3、圖3。

*：P<0.05，與Ctrl比較

圖3與Ctrl比較FEN1KD熒光定量數據分析結果

表3 與Ctrl比較FEN1KD熒光定量數據分析結果

3 討 論

基因組DNA攜帶著生命近乎完整的信息，卻時刻面臨著各種的損傷危險。這些致使DNA損傷的因素包括來自內源的代謝產物與來自體外環境來源的持續攻擊[12-13]。FEN1作為分枝結構特異性核酸酶，在DNA復制岡崎片段成熟過程中起著不可替代的作用。同時，FEN1在DNA修復通路中也具有重要作用。FEN1純合敲除小鼠模型胚胎致死。因此，為研究FEN1在低表達情況下細胞內基因的表達差異，以及所影響的細胞內代謝通路改變情況，本課題組前期構建了FEN1敲低細胞株SG67，并利用轉錄組測序方法對SG67及野生型對照細胞進行了轉錄組水平基因差異表達比較，獲取了大量的基因表達差異數據。

為驗證轉錄組測序結果的可靠性，本研究采用了目前相對靈敏、準確的熒光定量PCR方法。從選擇的10個差異基因中，成功設計了其中7個基因的擴增引物，并得到了單一可靠的DNA條帶。熒光定量分析結果與轉錄組測序結果相比較，7個基因的表達差異性均為一致。然而，ITPKB與EVA1C兩個基因利用熒光定量PCR方法在兩種細胞株中檢測到表達有差異，但差異無統計學意義(P>0.05)，反映轉錄組學數據后續定量PCR檢驗的必要性。另外檢測的5個基因中，SLC7A3及SLC6A11均屬于可溶性載體蛋白家族，對氨基酸的轉運具有重要作用[14]。MAGEB2基因屬于黑色素瘤超級家族成員，在腫瘤的發生過程中起重要作用[15]。HBE1基因為血紅蛋白的一個亞基，連同以上幾個基因均在FEN1敲低細胞株中表達下降，說明FEN1的下降導致蛋白轉運功能受阻，腫瘤發生等相關基因的表達發生改變。在FEN1敲低細胞株中表達上調的SPINT1基因屬于細胞生長因子激活物的抑制劑，具體調控機制還有待進一步的研究[16]。

綜上所述，本研究為進一步開發、分析轉錄組測序結果的可行性奠定了基礎，為進一步研究FEN1在細胞內的代謝通路情況奠定了基礎。