歸腎經方對慢性腎纖維化大鼠β-Catenin、Col1、LN 表達的影響＊

鄭小利，黃招蘭，胡姍姍，艾 萌，吳文莉，謝 岱，馬 威＊＊

（1.武漢科技大學醫院 武漢 430065；2.武漢市中西醫結合醫院 武漢 430030）

對治療《中醫內科學》中五臟分類疾病及肢體經絡病的代表方與疾病歸經的相關分析發現[1,2]，這些教材所用的經方（或驗方）非常強調病變部位與所選藥物歸經的一致性，因此推測在辨證論治原則指導下，根據病位，歸經選藥組方可以提高中藥療效[3]。本研究是在經驗方腎衰Ⅰ號的基礎上，選擇歸腎經的藥物組方，觀察其干預5/6 腎切除大鼠腎纖維化進程的療效及對Wnt經典信號基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠118 只（湖北省動物中心，合格證編號：4200601113、4200695028），體質量200±10 g，動物實驗完成于武漢市第一醫院SPF 動物室（SYXK（鄂）2014-030），動物設施使用編號：No.00070368。動物飼喂已輻照滅菌的維持飼料（北京華阜康公司），自由飲食，飲去離子水。動物室內12 h明暗交替，溫度21±1℃，濕度50%±10℃。

1.1.2 主要儀器

OLYMPUS AU2700 全自動生化分析儀、Sysmex-1800i全自動血球分析儀、圖像處理采用Biorad凝膠成像系統（美國伯樂公司）、PCR 儀（美國Thermo 公司），動物代謝籠。

1.1.3 主要試劑

雙縮脲法測定總蛋白（Total Protein，Tp）試劑（批號：L1306054）、酶法測定肌酐（Creatinine，Cr）試劑（批號：D1308083）均購于上海長征公司；紫外-谷氨酸脫氫酶法檢測尿素（Blood Urea Nitrogen，BUN）試劑（批號：20131032）購于上?？迫A公司；尿蛋白檢測試劑（批號）購于北京利德曼生化股份有限公司。Fermatas 分子生物學試劑，引物合成于武漢奧科鼎盛生物科技有限公司；抗體購于Abcam 公司，層粘連蛋白（laminin，LN）抗體（ab11575），膠原蛋白Ⅰ（Collagen，Col1）抗體（ab21287），β-Catenin，抗體（ab16051）。

1.1.4 治療藥物

治療用中藥飲片購于我院草藥房，由湖北天濟中藥飲片公司提供。經驗方腎衰I 號（黃芪30 g、太子參15 g、白術12 g、茯苓12 g、枸杞12 g、生地12 g、紅花12 g、益母草12 g、川牛膝12 g、赤芍12 g、當歸12 g、丹參12 g、木香6 g、厚樸12 g、熟大黃12 g）為B組，全部藥物均歸腎經處方（黃芪30 g、西洋參15 g、山藥12 g、澤瀉12 g、枸杞12 g、生地12 g、雞血藤12 g、益母草12 g、川牛膝12 g、丹皮12 g、阿膠12 g、熟地12 g、沉香6 g、砂仁12 g、熟大黃12 g）為C 組，全部藥物均不歸腎經處方（黃芪30 g、太子參15 g、白術12 g、薏苡仁12 g、麥冬12 g、玉竹12 g、紅花12 g、澤蘭12 g、川芎12 g、赤芍12 g、當歸12 g、丹參12 g、木香6 g、厚樸12 g、熟大黃12 g）為A組。三首組方均為195 g·劑-1，按常規方法煎煮，濃縮至1.5 g·mL-1，按體重換算后各組動物灌胃劑量為17.25 g·kg-1大鼠（相當于成人劑量）。

1.2 實驗步驟

1.2.1 5/6腎切除法制備腎纖維化模型[4]

上述動物適應性喂養5天后隨機分為2組：假手術組24 只和模型組94 只。造模動物3%戊巴比妥50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，從左腹部切口打開腹腔，動脈夾夾住左腎蒂后切除腎上下極（共切除2/3），以明膠海綿壓迫止血3 min，復位腎臟，逐層縫合，連續腹腔注射青霉素3 天。14 天后行第2 次手術，背部右側切口摘除右腎。假手術組采取同樣步驟暴露腎臟。自由飲食60天后（期間造模組死亡動物15只），分別隨機從2組中各取12 只動物，代謝籠收集24 h 尿液，記錄尿液容積并檢測尿蛋白濃度以計算24 h尿蛋白含量；禁食12 h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后腹主動脈采血，取腎組織，一部分4%多聚甲醛固定后備用，剩下分裝后-80℃保存備用。

1.2.2 分組治療

剩余造模組動物67只，按體重采用分層隨機方法分為4 組：A 組16 只（灌胃A 方），B 組17 只（灌胃B方），C組17只（灌胃C方），模型組17只與假手術組動物按相同劑量灌胃生理鹽水，連續60天。按1.2.1方法收集標本。

1.3 指標檢測

1.3.1 常規方法石蠟包埋，切片，HE染色。

1.3.2 Masson染色

用千屏軟件對Masson 三色法染色樣本進行圖像分析，每張腎組織樣本連續取十個視野圖像，其中膠原纖維呈綠色為陽性，用IPP6.0軟件計算上述10個圖片陽性面積平均灰度值值為該樣本結果。各組與假手術組陽性面積比例為該組膠原相對含量。

1.3.3 生化檢測

肝素抗凝血離心后分離血漿，以全自動生化分析儀檢測血BUN、Cr、Tp；EDTA 抗凝血混勻后以全自動血球分析儀檢測Hb；所收集的24 h尿液記錄尿量后，混勻取適量以全自動生化分析儀檢測24 h尿蛋白含量。

1.3.4 Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA 表達檢測

取各組冰凍保存腎組織50 mg，分別加1 mL Trizol提取總mRNA；經核酸含量檢測，調整樣本量逆轉錄合成cDNA；分別取1 μL 分cDNA 進行各指標PCR。Wnt2上游引物5'-TCAGGAAAACAGGCGACTATCTC-3'，下游引物5'-GCCTCTCCCACAACACATAACTT-3'，退火溫度60℃，產物長度257 bp；GSK-3β上游引物5'-CATCCTTATCCCTCCTCACG-3'，下 游 引 物 5' -TATTGGTCTGTCCACGGTCT-3'，退火溫度55℃，產物長 度96 bp；β-Catenin 上 游 引 物5'-CTTGGCTATTACGACAG ACT-3'，下 游 引 物5'-CAGCACCTTCAGCACTC-3'，退火溫度55℃，產物長度96 bp；LN物長上游引物5'-ccccaatctctgcgaaccat-3'，下游引物5'-agaggattgcaagcaca cga-3'，退火溫度60℃，產物長度216 bp；Col1a1 上游引物5'-caggctggtgtgatggg att-3'，下游引物5'-cacctcgttctccagccttt-3'，退火溫度58℃，產物長度73 bp；GAPDH 上游引物5'-GGTGCTGAGTATGT CGTGGAG-3'，下 游 引 物5'-CAGTCTTCTGAGTGG CAGT GAT-3'，退火溫度56℃，產物長度98 bp；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳（120V，50 mA），Biorad 成像系統掃描成像，用ImageJ軟件進行灰度分析，并分別與各自GAPDH結果進行比較計算各組指標表達相對含量。

1.3.5 免疫組織化學方法檢測LN、COL1、β-Catenin表達

經烤片、脫蠟、抗原修復、滅火內源性過氧化物酶、山羊血清封閉抗原、一抗孵育（LN或COL1，1∶80稀釋；β-Catenin，1∶100稀釋）過夜、二抗標記、DAB染色、蘇木素復染及中性樹膠封片完成IHC染色；結果判斷：以棕褐色為陽性表達。用千屏圖像采集系統連續采集每張玻片連續10個視野圖像，IPP6.0軟件計算每張圖片陽性表達的灰度值，再計算該樣本的平均灰度值。以空白組（LN、Col1、β-Catenin）表達為1，并計算各組相對表達值。

1.4 統計分析

統計分析用SPSS19.0 統計分析軟件進行，先進行正態性檢驗，若不符合正態分布則進行數據標準化；再進行方差同質性檢驗，若方差齊則接受方差結果并用LSD法進行兩兩比較，若方差不齊，則用Tamhane法進行兩兩比較。以P ＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 一般情況

分組治療過程中，假手術組大鼠狀態良好，生長及攝食無明顯異常，毛發光亮整齊，無死亡；模型組大鼠精神萎靡，飲食減少，消瘦，毛發枯槁，且脫毛，期間死亡6只；A組死亡1只；B組死亡2只；C只死亡1只。經檢驗，各治療組之間死亡率沒有差異（P ＞0.05）。

2.2 造模2月時，各組動物體質量、Hb比較

造模2 月，與假手術組比較，模型組體質量、Tp、Hb 顯著降低（P ＜0.05），BUN、Cr 含量顯著增高（P ＜0.01）（表1）。

表1 造模2月部分生化結果比較(n=12)

2.3 治療60天時，各組動物體質量、Hb比較

治療60天后，與假手術組比較，模型組體質量、Hb顯著降低（P=0.000）；與模型組比較，三治療組體質量均顯著增高（P=0.000），C 組Hb 含量顯著增高（P=0.000）；與C 組比較，A、B 組Hb 顯著降低（P=0.010,0.024）（表2）。

表2 治療后各組生化與Hb比較

2.4 各組動物血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白比較

與假手術組比較，模型組BUN、Cr、24 h 尿蛋白含量顯著增高（P=0.000）；與模型組比較，三治療組BUN、Cr、24 h尿蛋白含量均顯著降低（P=0.000）（表2）。

2.5 治療60天時，各組腎組織Masson染色比較

經方差檢驗，各組Masson染色結果之間有顯著性差異（F=160.304，P=0.000）。與假手術組比較，模型組膠原含量顯著增高（P=0.000）；與模型組比較，三治療組膠原含量均顯著降低（P=0.000）；與C 組比較，A組膠原含量顯著增高（P=0.011），B 組與之沒有差異（P=0.916）（圖1，表3）。

2.6 各組動物Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表達比較

方差齊性檢驗顯示，Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA 表達量的Lenvene 值分別為11.143，4.685，6.339，2.975，2.780（P 值分別為0.000，0.002，0.000，0.026，0.034），說明方差不齊。與假手術組比較，模型組Wnt2、GSK-3β、β-Catenin。與、LN、Col1a1 mRNA表達均顯著增高（P=0.000）；與模型組比較，各治療組Wnt2、GSK-3β、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表達均顯著降低（P=0.000）；A、B 組與C 組LN、Col1a1 mRNA表達沒有差異（P ＞0.05）（表3，圖2）。

表3 各組腎組織GSK-3β、Wnt2、β-catenin、LN、Col1a1 mRNA表達比較(±sd)

表3 各組腎組織GSK-3β、Wnt2、β-catenin、LN、Col1a1 mRNA表達比較(±sd)

與Sham組比較，*P ＜0.05,**P ＜0.01；與model比較，#P ＜0.05,##P ＜0.01；與C組比較，■P ＜0.05

Group n Masson染色Wnt2 GSK-3β β-catenin LN Col1a1 Sham 12 0.967±0.093 1.466±0.161 0.416±0.062 0.416±0.057 1.272±0.368 1.352±0.405 Model 11 8.560±1.359**2.505±0.597**0.784±0.062**0.828±0.067**2.726±0.662**2.393±0.672**A 15 3.143±0.977##■0.462±0.104##■0.510±0.064##0.517±0.064##1.501±0.343##1.616±0.434##B 15 2.335±0.617##0.611±0.116##0.322±0.070##0.378±0.058##1.471±0.354##1.540±0.402##C 16 2.086±0.473##1.100±0.200##0.394±0.101##0.408±0.072##1.432±0.351##1.451±0.291##F(P)160.304(.000)186.555(.000)91.809(.000)59.665(0.000)23.118(0.000)10.387(0.000)

圖2 各組腎組織GSK-3β、Wnt2、β-Catenin、LN、Col1a1 mRNA表達比較

表4 各組腎組織LN、Col1表達比較(IHC)(±sd)

表4 各組腎組織LN、Col1表達比較(IHC)(±sd)

與Sham組比較，*P ＜0.05,**P ＜0.01；與model比較，#P ＜0.05,##P ＜0.01；與C組比較，■P ＜0.05

Group n LN Col1 β-Catenin Sham 12 0.642±0.327 0.811±0.268 0.968±0.430 Model 11 1.302±0.396**1.441±0.397*8.332±1.441**A 15 1.020±0.210#1.075±0.218■5.814±0.915##■B 15 0.951±0.259##0.943±0.211 4.143±1.071##C 16 0.928±0.237##0.844±0.202#3.728±0.871##F(P)10.121(0.000)9.569(0.000)32.257(0.000)

2.7 各組動物腎組織Col1、LN、β-Catenin 表達比較（IHC）

方差齊性檢驗顯示，腎組織LN、COL1、β-Catenin ，表達量的Lenvene 值分別為0.373、0.000、0.000（表4，圖3-5）。與假手術組比較，模型組LN、COL1、β-Catenin，表達均顯著增高（P=0.001，0.042、0.000）；與模型組比較，C 組COL1 表達顯著降低（P=0.047），A、B、C 三組LN、β-Catenin，表達均顯著降低（P=0.013，0.002，0.001，0.005，0.003，0.000）。

圖3 各組腎組織Col1表達比較（IHC）（460倍）

圖4 各組腎組織LN表達比較（IHC）（400倍）

3 討論

中藥歸經理論是以臟腑經絡理論為基礎，是中藥藥理理論的一個重要組成部分。歸經理論的論述可以溯至《黃帝內經》之《素問·至真要大論》“夫五味入胃，各歸所喜，故酸入肝，苦先入心……”，表明味對機體不同部位有選擇性，即某種味主要入（或走或行）某一臟腑；《名醫別錄》最早指出藥物入某臟腑的性能，如韭歸心，蒜歸脾腎等；張仲景在《傷寒雜病論》中論述了部分藥物對人體臟腑經絡某部位的特殊作用和適應范圍；金元時期形成了比較系統的藥物歸經理論，張元素在《珍珠囊》中首次記錄部分藥物屬于“某行經藥”或“某經藥”，正式提出歸經學說，并倡導分經分部位用藥，李東恒、王好古均對歸經的內容進行了充實和完善，李東恒列出了十二經脈專藥，《湯液本草》專門記錄了80余種入、走、到經的藥物?！皹I醫不知臟腑，則病源莫辨，用藥無方”。歸經將臟腑辨證中的病證與藥物作用于人體的部位聯系起來，而藥物的作用部位取決于病的定位，因此中藥歸經與病的定位有密不可分的聯系?！凹膊w經”是指在辨證基礎上辨明病位，為選擇相應歸經的藥物指示方向[5]。

圖5 各組腎組織β-Catenin表達比較（IHC）（與HC比較）

對《中醫內科學》中五臟疾病遣方用藥歸經的統計表明，疾病的五臟定位與所用藥物的歸經趨向一致，如治療心系疾病的藥物多數歸心經（175味，占治療心系疾病全部藥物歸經38%，最多）；治療肺系疾病的藥物多數歸肺經（216 味，占44%，最多）；治療肝系疾病的藥物多數歸肝經（192 味，占29%，最多）；治療脾系疾病的藥物多數歸脾經（121 味，占37%，最多）；治療腎系疾病的藥物歸心經藥（175 味，占30%，最多），歸腎經藥37 味，占10%，交其他系疾病歸腎經藥物占比增加1 倍。這些經方（或驗方）中的藥物歸經有主有次，一方面說明方中藥物使用有明確的目的，主要針對病變部位用藥；另一方面人體內各臟腑之間的關聯性（整體觀及五行傳變）[6]。《中醫內科學》中肢體經絡疾病并未納入五臟分類，治療肢體經絡病的藥物歸經統計顯示以歸肝經者最多，說明肢體經絡病證歸結于肝經[7]，據此，潘靜等[8]以當歸拈痛湯為驗方，調整其中歸肝經藥物的含量（由6.7%調整至46.7%），而調整后的當歸拈痛湯對急性痛風性關節炎患者在降低血尿酸水平和緩解急性期癥狀上明顯優于原方（P ＜0.05）。本研究亦是在此理論指導下，組成的歸經方，歸腎經藥物比例從13.5%提高至34.1%。

Wnt/β-Catenin 信號通路在生物進化過程中的一條極為保守而又繁雜的信號通路，參與調控細胞的遷移、增殖、分化、凋亡、上皮間質轉化等過程，在腎臟，該信號途徑參與腎臟的發育，以及多囊腎、糖尿病腎病、急性腎損傷、腎腫瘤等多種疾病的發病過程。正常情況下Wnt 信號靜默，胞質中僅有少量β-Catenin 游離，絕大多數β-Catenin 與E-cadherin 形成復合體；而由GSK-3β；、Axin（骨架蛋白）和APC（結直腸腺瘤性息肉基因產物）組成的降解復合物促使游離的β-Catenin被蛋白酶降解，從而維持胞內β-Catenin的低水平。Wnt/β-Catenin 信號通路在腎纖維化進程中的地位已經得到腎病學者的認同[9-11]，Wnt蛋白通過激活下游的各種因子，促進β-Catenin 在胞質及胞核中過度聚集，促進目的基因轉錄表達，生成各種相關炎癥介質及致纖維化因子，最后導致腎細胞增生、轉分化，形成腎臟纖維化[12]。LN是種大分子多功能糖蛋白，可識別細胞表面受體是基膜與細胞緊密結合，是基膜的主要成分，對基膜的構建和穩定有重要作用[13]。

本研究顯示，三治療組均能降低β-Catenin 的聚集和表達，降低COL1的基因表達，層粘連蛋白表達均顯著降低，而歸腎經組膠原蛋白表達顯著降低，其他兩治療組沒有顯著性差異（與模型組比較），推測三治療組均能通過Wnt/β-Catenin 號途徑改善模型動物纖維化狀態，歸腎經組在改善貧血狀態、降低腎組織膠原蛋白表達上更明顯，但三治療組之間Wnt 經典信號通路的主要蛋白β-Catenin等基因的表達上沒有差異，其調節機制還需要進一步研究。