肺癌轉移基礎研究與中醫藥轉化研究展望＊

闕祖俊，武曉秋，羅 斌，錢芳芳，劉海濤，楊 蘊，張 戈＊＊，田建輝,＊＊

（1.上海市中醫藥研究院中醫腫瘤研究所 上海 200032；2.香港浸會大學 香港 999077；3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院 上海 20032）

惡性腫瘤嚴重危害人類健康，而肺癌是發病人數和死亡人數最高的惡性腫瘤[1]。隨著早期診斷技術的發展，肺癌早期術后患者的比例不斷升高[2]，而術后轉移是導致肺癌患者生存率低的主要原因[3]，因此急需研發抗肺癌轉移新藥以提高臨床療效。目前的化療、分子靶向、免疫治療等，對于早期肺癌患者的療效獲益有限[4,5]，其關鍵是對肺癌轉移的研究思路及其機制的探討缺乏整體觀的認識；主要表現在目前肺癌的基礎研究和藥物開發主要基于原發灶的腫瘤組織，采用基因組、蛋白組、表觀遺傳和代謝組等現代的一系列先進技術進行多組學聯合檢測[6]，然而轉移的發生是已經脫落進入外周血的循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）遷移至靶器官，進而增殖成病灶，所以轉移的干預要以機體內環境為中心，以CTCs 為靶點展開，可能會取得突破。通過系統梳理目前肺癌轉移研究中的思路瓶頸，聯合現有的科學技術進展，促進中醫理論指導現代技術的融合，以傳承創新發展中醫藥，提高基礎與臨床的轉化，提高中醫藥在臨床中療效進步。

1 肺癌的轉化研究效率亟待提高

目前肺癌分子靶向治療和免疫治療已經在臨床取得一定成效，然而晚期肺癌患者的5 年生存率仍低于20%，其關鍵是轉移的發生，且目前缺乏針對早期肺癌轉移有效藥物[3]。其主要原因是體外抗肺癌轉移的篩藥平臺主要是基于美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）提 供 的NCI-60 細 胞，而 這 些NCI-60細胞主要來源于原發灶，且在二維培養條件下進行抗腫瘤化合物的篩選[7]。體內研究采用NCI-60細胞在免疫缺陷小鼠皮下建立移植瘤模型，篩選抗腫瘤化合物對腫瘤生長的抑制作用，其弊端是皮下移植的腫瘤屬于異位種植，忽視了其起源組織器官的微環境和內環境。基于上述模型篩選得到的化合物與臨床療效的關聯程度不高，導致目前從基礎到臨床的轉化效率極低。

科學的模型體系是腫瘤轉化研究的關鍵。目前國際認可的抗癌藥物療效預測模型主要是人源腫瘤組織異體移植物模型（patient-derived tumor xenografts,PDX），PDX是將人原發腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內進行擴增，然后用于預測抗癌藥物的療效。該方法比傳統的細胞系更為穩定，其基因表達、突變狀態、轉移潛能、藥物反應均能更好地保持一致，也更適合用于科學研究。近年來，人源腫瘤類器官模型（patientderived organoids，PDO）成為新的方向，PDO 是一種基于三維細胞培養系統建立的模型，這些類器官在組織學、分子水平和功能上能夠持續與來源腫瘤組織保持高度一致，能很好地反映原發腫瘤的特點，可用于藥物反應性試驗等研究[8]。雖然PDX和PDO模型可用于篩選抗肺癌藥物，由于該模型的建立同樣基于原發灶腫瘤組織，因此其缺乏抗腫瘤轉移治療的精準靶點，也難以客觀評價干預方法的實際效果，這是目前缺乏抗肺癌轉移藥物的真正原因。因此急需創新肺癌轉移研究平臺，建立起符合肺癌臨床實際發病特征的體內與體外研究模型。

2 基于“正虛伏毒”構建肺癌轉移特異性研究平臺

田建輝針對肺癌發生和轉移提出“正虛伏毒”的理論觀點，認為循環腫瘤細胞是轉移發生的潛在伏毒。癌癥的轉移“種子”和“土壤”假說提示CTCs 可能是腫瘤轉移的“種子”[9]。大量臨床研究表明外周血中CTCs的數量和功能狀態與腫瘤遠處轉移的發生和預后密切相關[10]。Wang 等研究發現CTCs 數目和CTC 細胞簇可作為乳腺癌患者疾病進展和生存的獨立預后因子[11]。Aceto等研究發現，血液中的CTC細胞簇是單細胞轉移能力的23-50 倍，而采用納鉀ATP 酶抑制劑解離CTC細胞簇可抑制乳腺癌的轉移[12,13]，提示通過干預CTC進而預防轉移發生可能是提高肺癌患者生存的關鍵。

為模擬肺癌臨床實際發病過程，田建輝課題組首先從早期肺癌患者外周血中富集、分離、建立了肺癌循環腫瘤細胞系（CTC-TJH-01）。體外研究發現CTCTJH-01 細胞處于上皮間充質轉化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）的中間階段，具有耐藥性強、干細胞表型和免疫逃逸特征[14]。體內研究發現CTC-TJH-01細胞在免疫缺陷小鼠上具有致瘤性和肺轉移能力[14]，提示了外周血中的CTCs可能是轉移的關鍵因子。

圖1 懸浮培養的CTC-TJH-01細胞形態學觀察

2.1 肺癌轉移特異性體外研究模型

課題組采用聚甲基丙烯酸羥乙基酯（poly-HEMA）建立了CTC-TJH-01 細胞懸浮生長模型，發現懸浮培養后的CTC-TJH-01 細胞可自身聚集形成細胞簇（圖1），其結構與類器官相似，此外還具有生長抑制、細胞周期阻滯、失巢凋亡抵抗和對化療藥物不敏感等生物學特征。基于該模型可篩選出解離CTC 細胞簇或誘導CTC 細胞簇發生失巢凋亡的化合物，其可能是潛在的抗肺癌轉移藥物。

2.2 肺癌轉移特異性體內研究模型

首先，采用CTC-TJH-01細胞構建攜帶GFP/luc雙標的CTC-TJH-01-GFP/luc 細胞系。其次，采用NCG小鼠構建模擬人源化小鼠，即提取人外周血單核細胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），將PBMCs與CTC-TJH-01-GFP/luc 細胞通過尾靜脈共注射接種于NCG小鼠體內，通過活體成像動態觀察小鼠肺部成瘤情況。該模型可用于篩選基于免疫治療的抗肺癌轉移藥物。

3 精準的肺癌免疫干預是未來阻斷肺癌轉移的關鍵途徑

肺癌的免疫治療已成為肺癌的主流方法，已顯示出的巨大潛力。隨著“免疫監視”學說和“免疫編輯”理論的相繼提出，腫瘤治療策略也由“殺瘤”逐漸向調節腫瘤微環境轉變[15]。血管生成抑制劑、免疫檢查點抑制劑等調控腫瘤微環境的小分子藥物逐漸走進臨床，通過恢復機體自我抗病能力以抑制腫瘤生長的策略也取得臨床顯效[16]。2018年諾貝爾生理或醫學獎授予美國免疫學家詹姆斯·艾利森與日本免疫學家本庶佑，表彰他們“發現負性免疫調節治療癌癥的療法”。證明以調控自身抗病能力治療癌癥的方法是具有堅實的科學基礎。腫瘤免疫研究經歷了從腫瘤細胞為中心向腫瘤微環境轉變，但是目前臨床藥物的研發多以腫瘤細胞為篩選對象，因此對于轉移干預的療效欠佳。

劉嘉湘早在上世紀70 年代在全國首先倡導扶正法為主治療惡性腫瘤的觀點，認為腫瘤是局部屬實、全身屬虛，而調節機體內在的抗病能力是提高臨床療效的關鍵[17]；隨后朱惠蓉發現以“扶正治癌”為指導的中醫藥可以通過調節神經-內分泌-免疫軸發揮治療作用，提高療效[18]；田建輝發現“扶正治癌”指導下形成的肺積方具有下調機體腫瘤微環境中吲哚胺2，3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)表達，逆轉免疫逃逸的作用[19]。目前以IDO為干預靶點的小分子抑制劑藥物正在開展臨床研究；上述研究均提示了調控機體微環境是中醫藥發揮作用的重要途徑，但是其具體的干預機制仍待深入研究。

目前轉移的干預是臨床治療的難點，其關鍵是轉移的機制不明確。腫瘤轉移不是繼發器官的“消極”接受，而是“積極”地準備適宜環境。在2005 年，Kaplan教授提出轉移前微環境（The Pre-metastatic niche,PMN）概念，即遠處的靶器官在腫瘤細胞到達之前，先形成適合腫瘤細胞定植、生長、增殖的局部微環境[20]；花寶金課題組發現中藥復方雙參顆粒可以干預髓源性抑制細胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells,MDSCs）在PMN 形成中的免疫抑制作用[21]；而課題組前期研究發現外周血MDSCs 的表達與非小細胞肺癌的臨床分期具有相關性[22]；因此，外周免疫逃逸將成為阻斷腫瘤細胞進入PMN形成微轉移的重要干預環節。

基于外周免疫逃逸，研究發現非小細胞肺癌患者外周血中循環腫瘤細胞的表達水平具有一定的規律，即早期患者明顯高于晚期患者[23]；課題組在提取患者外周血的循環腫瘤細胞對其生物學特征進行研究發現，循環腫瘤細胞與原代細胞相比，具有更強的耐藥性、干細胞特性以及休眠的特點[24]；這在某種程度上揭示了目前轉移干預療效不佳的原因。因此，我們建立了以循環腫瘤細胞為基礎的臨床篩藥平臺，積極探索從外周免疫逃逸干預轉移的關鍵靶點。而提高外周自然殺傷細胞的功能，有望促進NK細胞對CTC清除，預防轉移的發生。

4 系統生物學技術成為揭示中醫藥復方調控肺癌的機制的重要技術

中醫藥抗轉移在臨床得到了一定的驗證，但是由于中醫藥復方發揮作用的多成分、多途徑、多靶點，導致其機制研究一直難以突破。而2001 年，Leroy Hood的系統生物學概念的提出，為解決這一瓶頸提供了有效手段[25]。張衛東教授[26]建立了集系統生物學、網絡生物學、現代藥理研究及化學物質基礎研究為一體的現代中藥復方研究體系，確立了以自上而下的系統論與自下而上的還原論相結合、宏觀與微觀相結合、體內與體外相結合的研究模式；李梢教授[27]通過應用網絡藥理學技術對腫瘤扶正祛邪中藥進行統計研究發現，中藥治療比直接殺傷腫瘤細胞在調節腫瘤免疫微環境和腫瘤預防方面具有更大的潛力。

中醫藥復方的多組分決定了其作用機制的多途徑及多靶點；而系統生物學的優勢正是通過點-線-面-網的角度將中醫藥不同組分的聯合作用進行整體分析，進一步揭示了中醫藥的整體干預機制。如李洪霖等[28]采用基因/蛋白網絡分析的方法預測加味附子理中湯抑制肺癌的分子機制及抗腫瘤靶點，發現加味附子理中湯及其拆方人參蓽茇組可能通過調控TGF-β1/SMAD2/3、Wnt/β/β-catenin、Gli/Hedgehog 信號通路發揮對LLC 荷瘤小鼠的抑制作用，并可多目標調節腫瘤及腫瘤微環境分子網絡來實現特定效果。

系統生物學在揭示中醫證候的內涵與特征中也發揮相當重要的作用，因其具有共同的特點——復雜的人體。證候的演變必然存在著特殊的物質基礎，而蛋白質和多肽是機體生命活動的執行者，因此，證候的變化必然由蛋白質或多肽的質、量或空間結構的改變等引起。如馬俊杰等[29]在胸腔鏡下獲取了120例NSCLC患者的腫瘤組織，通過氣相色譜-質譜（GC-MS）法觀察其代謝物成分，發現中醫證型與肺癌組織代謝組學存在一定的相關性，以乳酸、葡萄糖、肌醇、磷酸膽堿為最敏感的診斷化合物。楚瑞閣等[30]發現EGFR 在肺陰虧虛型、氣血虧虛型、痰濕蘊肺型、腎陽虛衰型、肺脾氣虛型呈上升趨勢，根據EGFR 在不同證型中的差異性表達或許可以指導臨床用藥。

網絡藥理學已逐漸應用于中醫藥基礎研究領域，通過構建“藥物-靶標-疾病”相關網絡，有助于深入研究中藥復方的具體作用機制，有助于中藥復方新藥的研發，并發現其多靶點的潛在治療作用。羅國安教授[31]提出，中藥復方（外部干預系統）與人體（生物應答系統）之間是“系統-系統”的相互作用關系，并給出了從臨床出發，以信號通路為靶標的復方新藥的研發策略。

5 腸道菌群在肺-腸軸中調控肺癌轉移的作用

腸道菌群因其種群數量巨大，與人體的生理功能密切相關，被稱為人的“第二基因”。其中，除了維持內環境穩定的最主要功能，對于肺癌來說，腸道菌群對于適應性免疫的調節作用不容忽視。近來研究顯示免疫檢查點抑制劑的療效與腸道菌群的調控作用密切相關[32]。目前的研究認為腸道菌群的作用主要在于輔助性T細胞（Th）和調節性T細胞（Treg），通過促進Treg表達負調控免疫，幫助維持腸內穩態[33]。腸道是人體最大的免疫器官，而在腸道中定居的菌群是調節腸道免疫的重要因素。

中醫傳統理論認為“肺與大腸相表里”，而現代研究證實腸道菌群可通過調節免疫細胞的分布，進而調控肺臟的區域免疫狀態。研究發現CCL25/CCR9 軸介導了肺源性CCR9+CD4+T 細胞進入腸道，改變腸道微生物群的組成并引起腸道免疫損傷[34]。GUI 等發現使用萬古霉素等抗生素混合藥物破壞小鼠微生物菌群環境后，順鉑對于Lewis 肺癌小鼠的抗癌作用下降，而使用乳酸桿菌處理的小鼠則顯示出增強的抗腫瘤反應[35]。上述研究均證實了中醫理論“肺與大腸”相表里的科學性，同時表明中醫藥研究要注重“間接應答”，通過調節腸道菌群的平衡或是通過調節腸道菌群的代謝發揮其治病作用。因此，通過腸道菌群的干預來調控肺臟區域免疫，進而到達防治腫瘤的目的，具有一定的應用前景。

6 適配子技術促進肺癌基礎-臨床轉化

6.1 核酸適配子技術的優勢

核酸適配子（aptamer）是一種類似抗體且能特異性與靶物質結合的新型識別分子，其可以與靶點分子（蛋白質，病毒，細菌，細胞，重金屬離子等）高特異性和高親和力結合。在臨床上核酸適配子可用于生物成像與腫瘤早期診斷，Tan 等[36]通過cell-SELEX 技術篩選出了可特異性識別胰腺導管癌的核酸適配體XQ-2d，其可為胰腺導管癌的診斷與治療提供分子識別成像探針。Tan 等通過細胞篩選獲得了能與人急性淋巴細胞白血病T 細胞（CCRF-CEM）相結合的核酸適配子sgc8，以及能與Burkitt's淋巴瘤細胞結合并具有高親合力的核酸適配子TD05[37]。此外，核酸適配子還可用于檢測微小殘余病灶和微轉移灶。即針對特定腫瘤細胞的核酸適體，可以直接用作探針探測腫瘤細胞。上官等通過細胞-SELEX方法篩選得到特異性DNA適配子sgc8、sgc3、sgd3和KH1C12，sgc8、sgc3和sgd3能夠從腫瘤和骨髓細胞混合物中識別T淋巴細胞白血病細胞，而KH1C12能夠識別急性髓細胞樣白血病細胞[38]。

6.2 核酸適配子偶合循環腫瘤細胞，實現對轉移的精準干預

循環腫瘤細胞是肺癌發生轉移的重要因素，但存在富集效率低的問題。基于核酸適配子的富集及檢測方法還能快速高效捕獲和釋放CTCs，并對CTCs 進行定性和定量分析，且能檢測出血液中的單個CTCs和不同亞群的腫瘤細胞。Song 等篩選到EpCAM 的核酸適配子SYL3C，可以從培養基中的混合細胞中識別出靶細胞[39]。

核酸適配子不僅具有分子識別功能，還可能具有信號轉導及調控作用，故有可能發展成為一類新型抗腫瘤藥物用于治療腫瘤。目前已篩選出數十種具有潛在臨床應用價值的抗腫瘤核酸適配子（如AS1411，REG-1 等），其中某些特異性核酸適配子無需經過修飾即具有顯著的抗腫瘤作用。同時，核酸適配子可以通過不同途徑偶聯化療藥物、納米顆粒以及小分子藥物，達到精準靶向治療作用，提高靶向癌癥的效率。如Chen 等[40]利用cell-SELEX 技術成功篩選到只識別小細胞肺癌細胞系NCI-H69 而不識別非小細胞肺癌細胞系NCI-H661的核酸適配子。這些研究顯示了核酸適配子在早期肺癌檢測中的潛力，以及通過靶向CTCs的核酸適配子偶聯納米顆粒可能具有抗肺癌轉移的能力。

7 人工智能促進肺癌基礎和轉化研究效率

人工智能（Artificial intelligence AI）技術已融入肺癌的全程管理當中。影像診斷與AI 深度結合大大提高了放射科醫生的工作效率，在肺癌早期診斷的背景下深度學習已經運用于肺部影像的成像診斷[41]。藥物研發需要整合大量高通量組學數據、網絡藥理學數據乃至圖像等高維表型數據，面對這些數據，人工智能技術在藥物設計領域顯示出巨大的前景[42]。人工智能深度習方法可以進行數據挖掘信息分析，解釋與制藥相關的大數據以發現新的藥物[43]。人工智能強大的特征提取、深度學習能力已經可以應用相關的技術來預測結構，因為大多數疾病與蛋白質功能紊亂有關，從序列預測蛋白質折疊，研究蛋白質的結構，這種基于結構的藥物設計策略可以用來發現活動的小分子朝向蛋白質的目標[44]。

由于很多藥物并非是單一靶點而是多靶點的發揮效應，特別是中藥復方，其發揮作用機制復雜，靶點眾多，開發研究難度高。藥物研發將涉及基因調控網絡，代謝網絡，蛋白質網絡，藥物靶點網絡，藥物-藥物網絡、藥物-疾病網絡、目標疾病網絡、藥物不良反應網絡和疾病-疾病網絡[45]，人工智能技術可以將多個網絡集成到形成用于改變一種藥物用途的異構網絡。藥物目標的預測是作為從藥物到疾病的橋梁[46]，一種通過網絡擴散算法整合多個網絡信息的異構網絡用于預測新的目標和適應癥[47]。這也符合中醫理論中“同病異治”、“異病同治”的概念。最后人工智能的數據分析功能可以規避既往臨床研究中遇到過的問題，避免重復錯誤，優化設計方案。相信在不久的將來，AI 技術將被期待涵蓋新藥發現和開發的所有環節[43]，最終在藥物研發中不可或缺。

8 展望

8.1 完善轉移特異性平臺，促進肺癌轉化研究

在腫瘤的轉移過程中，外周循環中的腫瘤細胞所起的關鍵作用已經得到充分重視。越來越多的研究表明外周血中的CTCs可通過與血小板結合、與中性粒細胞結合、或自身聚集形成CTC 細胞簇，而CTC 細胞簇的轉移能力顯著強于單個CTC 細胞，其可能的機制是CTC細胞簇具有失巢凋亡抵抗、逃逸外周免疫殺傷、抵抗外周剪切力的能力[12,13,48]。此外，Liang等研究發現晚期肺癌患者的CTCs水平與外周血中的NK細胞比例呈負相關[49]；Mao等也發現基于NK細胞介導的免疫治療可以顯著降低晚期肺癌患者外周血中的CTCs數目[50]。提示NK細胞控制腫瘤轉移可能通過抑制外周血中的CTCs。因此，采用核酸適配子技術靶向外周血中的CTCs，尤其是CTCs 細胞簇，或通過提高NK 細胞對CTCs的識別殺傷，這可能是防治肺癌轉移的關鍵策略。

8.2 引入系統生物學思維和技術，促進機制研究的突破

肺癌轉移是目前制約臨床總體療效提高的瓶頸，深入開展轉移機制研究是提高防控效果的前提。轉移是一種多步驟，多環節的系統性疾病，需要有系統思維的指導。而系統生物學和中醫學具有內在的一致性，都有重視整體觀念的優勢，為中醫藥防治肺癌研究提供了合適的理論參考和研究工具。目前采用系統生物學思維指導肺癌的中醫藥研究已經成為主流方法。從基因組學、蛋白質組學、表觀遺傳學、代謝組學、免疫組學等角度開展肺癌的證候研究、療效機制研究等已經有較多的報道。而腸道菌群研究也是從系統角度出發、以免疫調控為切入點研究中醫藥防控肺癌的重要領域，尤其契合“肺與大腸相表里”、“脾為后天之本”等中醫理論核心理念，研究的內容和深度逐漸增加。國內張衛東、羅國安、李梢等在系統生物學思維啟發下，主導建立了網絡藥理學平臺、中藥復方新藥研發等平臺，揭示了證候基礎和中藥復方新藥的作用基礎。人工智能技術在分析多組學大數據中更有獨特優勢，已經滲透到肺癌臨床診療管理、藥物研發等領域，隨著多組學的產生日劇加快，基于大數據的人工智能將在肺癌的轉化研究中起到更重要的作用。

8.3 積極融合現代科學技術，促進肺癌基礎和轉化研究效率

隨著生命科學和信息科學的飛速發展，新理論和新技術不斷涌現。中醫藥研究要結合自身重視整體和思辨的學科特點，積極融合現代科技發展，尤其是系統生物學、人工智能和量子力學等學科的發展，促進自身學科理論的更新和完善。

中醫藥具有“治未病”的優勢，在預防肺癌發生和復發轉移中具有很大潛力。

要積極進行肺癌發病理論的理論創新和技術平臺創新，為轉化研究提供平臺，最終提高中醫藥防控肺癌的整體效果。