不同工藝的絞股藍(lán)總甙降血脂作用的對(duì)比研究＊

匡艷輝，張偲偲，朱晶晶，王德勤，王智民，覃仁安，李楚源

（1.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510515；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino隸屬于葫蘆科絞股藍(lán)屬，多年生草質(zhì)藤本植物，味苦，性寒，無(wú)毒，且含有比較豐富的絞股藍(lán)皂苷、多糖、黃酮及人體必需的8種氨基酸和多種微量元素等成分。其主要化學(xué)成分是皂苷類(lèi)，具有抗高脂血癥、抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用，因含有人參皂苷故又稱(chēng)為“南方人參”和“第二人參”[1-4]。藥材經(jīng)過(guò)提取分離、純化精制、制劑后得到的絞股藍(lán)總甙片，具有養(yǎng)心健脾，益氣活血，除痰化瘀，降血脂等功效，尤其在降血脂方面療效優(yōu)異，具有很好的市場(chǎng)前景[5,6]。

隨著CFDA 對(duì)中藥提取物政策的放開(kāi)和加強(qiáng)監(jiān)管，企業(yè)可以自制提取物以滿(mǎn)足制劑的需求[7]。絞股藍(lán)總甙主含達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷，這種皂苷具有熱不穩(wěn)定性，有許多絞股藍(lán)皂苷在水浴加熱時(shí)易形成C-20 位去糖基的次生苷、苷元和次級(jí)苷元等。因此，不同制備工藝對(duì)絞股藍(lán)皂苷的種類(lèi)、含量和組成比例影響較大，有可能直接影響其藥效[8-11]。

由于絞股藍(lán)總甙提取物工藝1 僅經(jīng)過(guò)提取、分離及干燥所得，而工藝2 通過(guò)前期的工藝優(yōu)化后加入了純化步驟，并采用更加先進(jìn)的干燥技術(shù)，所以在總皂苷含量方面，優(yōu)化后的工藝2的要比工藝1的高。在此基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目擬以活性為導(dǎo)向來(lái)評(píng)價(jià)不同絞股藍(lán)總皂苷制備工藝，通過(guò)飼喂高脂高膽固醇飼料，建立大鼠高脂血癥模型，觀察工藝優(yōu)化前后的絞股藍(lán)總甙對(duì)高脂血癥的保護(hù)作用[12-15]，為絞股藍(lán)總甙后續(xù)的工藝優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

絞股藍(lán)總甙工藝1 提取物（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號(hào)：1706001），絞股藍(lán)總甙工藝2 提取物（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，批號(hào)：M170603），烏來(lái)糖（室溫保存，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120316），0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)，批號(hào)：20150806），阿托伐他汀鈣片（北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：161119）。

1.2 儀器

DY89-Ⅱ型電動(dòng)勻漿機(jī)；德國(guó)SIGMA3-18K 低溫高速離心機(jī)；美國(guó)BioTek ELx800 酶標(biāo)儀；日本日立7100 全自動(dòng)生化分析儀；病理圖像分析系統(tǒng)，包括OLYMPUS BX41 顯微鏡（日本）和DP71+IPP6.0圖像采集系統(tǒng)；IPP6.0圖像采集系統(tǒng)。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20g），湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0004。

2 方法和結(jié)果

2.1 藥效指標(biāo)測(cè)定、樣品采集及統(tǒng)計(jì)分析方法

取90 只SD 大鼠，隨機(jī)分為9 組，每組10 只，在絞股藍(lán)各劑量組中，低、中、高劑量組分別為0.016、0.032和0.064 mg·kg-1·d-1，（按體重-體表面積轉(zhuǎn)換折算，約相當(dāng)于成人臨床日服用生藥量180 mg的1、2和4倍），具體分組及各組別劑量設(shè)置情況（表1）。除正常對(duì)照組飼喂正常飼料外，其余各組分別飼喂含有1.2%膽固醇的高脂飼料（52.2%基礎(chǔ)飼料+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉+蔗糖20%+豬油15%+酪蛋白10%+磷酸氫鈣0.6%+石粉0.4%+預(yù)混料0.4%）33 天。高脂血癥模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：與正常對(duì)照組相比，模型組血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白高密度脂蛋白膽固醇（LDLC）四項(xiàng)指標(biāo)中有兩項(xiàng)的水平顯著升高。在造模的同時(shí)，各組大鼠于每日上午灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)給藥33天。

表1 組別、劑量設(shè)計(jì)一覽表

具體觀察和檢查包括一般狀況觀察、體重、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平、血清游離脂肪酸（FFA）、肝組織超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平等指標(biāo)，具體測(cè)定方法如下：

血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平：于試驗(yàn)期第12天對(duì)每組的5 只大鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢采血；末次給藥后，全部動(dòng)物用烏來(lái)糖麻醉后，腹主動(dòng)脈取血；兩次的血樣經(jīng)室溫靜置2 h后，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清。采用日立7100全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平。

血清FFA：末次給藥后，全部動(dòng)物用烏來(lái)糖麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清。血清中按照FFA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

SOD、還原型GSH和MDA水平：末次給藥后，處死大鼠，置于-80℃冰箱保存。每組取5只大鼠的肝組織用生理鹽水按重量體積比（1∶9）制備組織勻漿液， 3 000 r·min-1 離心10 min，吸取上清。分別按照SOD、GSH和MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清SOD、還原型GSH和MDA含量。

ALT和AST水平：末次給藥后，全部動(dòng)物用烏來(lái)糖麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清。采用日立7100 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清ALT、AST的水平。

統(tǒng)計(jì)分析方法：所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以（xˉ±s）的形式表示，各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行組間比較之前先進(jìn)行組間方差分析（F 檢驗(yàn)），當(dāng)組間方差齊同時(shí)，組間比較采用Student-T 檢驗(yàn)（非配對(duì)的t 檢驗(yàn)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間方差不齊時(shí)，采用校正的Student-T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)P ＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P ＞0.05認(rèn)為不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 一般狀態(tài)觀察

試驗(yàn)期間，各組動(dòng)物進(jìn)食、飲水、排泄、一般狀況均未見(jiàn)明顯異常。

2.3 體質(zhì)量

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠體重明顯升高。與模型組相比，給藥33天后各給藥組大鼠的體重未見(jiàn)明顯差異，表明絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)模型大鼠的體重沒(méi)有影響（表2，表3）。

表2 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)高脂血癥雄性大鼠體重的影響（±s,n=5）

注：與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.05。

組別劑量（/g·kg-1）第一周第二周體質(zhì)量/g第三周第四周正常對(duì)照組— 265.2±10.8 299.4±15.1 353.2±26.7 374.2±30.2模型組—296.2±12.2#336.8±20.2#392.8±21.8#426.0±18.6#工藝1低劑量組0.016 292.2±16.3 338.6±17.0 402.6±24.1 439.6±26.6工藝1中劑量組0.032 286.0±17.4 317.4±25.0 368.0±27.1 400.8±26.1工藝1高劑量組0.064 306.4±18.5 342.8±25.3 401.0±32.0 432.2±32.3工藝2低劑量組0.016 298.6±12.2 338.6±13.2 394.2±14.1 413.0±14.9工藝2中劑量組0.032 290.8±17.7 334.4±15.9 403.2±17.5 439.2±21.6工藝2高劑量組0.064 296.6±21.7 338.4±34.9 402.6±43.7 435.8±49.8阿托伐他汀鈣組0.005 297.8±15.1 337.0±17.1 395.8±22.2 424.4±26.8

2.4 血清TC和TG含量

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清TC含量明顯升高，連續(xù)33天給予阿托伐他汀鈣（5 mg·kg-1）后模型大鼠血清TC 含量明顯降低。說(shuō)明模型建立成功。12天后模型組大鼠血清TG含量平均為4.15 mmol·L-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而33天后，模型組大鼠血清TG含量平均為0.56 mmol·L-1，與正常對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異。

與模型組相比，工藝1 高劑量組，工藝2 高劑量組大鼠血清TC 含量能顯著降低模型大鼠血清TC 含量，其余劑量組與模型組相比未見(jiàn)明顯差異。

給藥12 天及33 天后，各給藥組大鼠血清TG 含量與模型組相比均未見(jiàn)明顯差異（P ＞0.05）。具體數(shù)值（表4）。

2.5 血清LDL-C、HDL-C和FFA含量

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清LDL-C 含量明顯升高，HDL-C 含量明顯降低，F(xiàn)FA 含量明顯升高；連續(xù)33 天給予阿托伐他汀鈣（5 mg·kg-1）后模型大鼠血清LDL-C 含量明顯降低，F(xiàn)FA含量明顯降低。說(shuō)明模型建立成功。

與模型組相比，工藝1 高劑量組、工藝2 中劑量組及高劑量組能顯著降低LDL-C 含量。其余劑量組未見(jiàn)明顯差異。而各給藥組大鼠血清HDL-C 含量與模型組相比未見(jiàn)明顯差異。工藝1高劑量組、工藝2高劑量組能顯著降低模型大鼠血清FFA 含量。其余劑量組未見(jiàn)明顯差異。具體數(shù)值（表5）。

表3 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)高脂血癥雌性大鼠體重的影響（±s,n=5）

表3 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)高脂血癥雌性大鼠體重的影響（±s,n=5）

注：與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.05。

組別劑量（/g·kg-1）第一周第二周體質(zhì)量/g第三周第四周正常對(duì)照組— 213.0±15.6 220.0±12.8 237.6±15.0 253.6±19.5模型組—229.8±11.9 246.6±17.3#269.0±17.5#282.8±19.1#工藝1低劑量組0.016 228.4±7.6 243.0±9.6 253.0±15.1 272.6±11.9工藝1中劑量組0.032 227.8±7.7 240.4±18.3 274.2±17.3 286.6±20.8工藝1高劑量組0.064 214.4±8.7 230.0±9.8 254.4±10.3 269.6±12.8工藝2低劑量組0.016 231.6±14.4 243.2±19.8 271.2±22.6 276.0±25.6工藝2中劑量組0.032 226.4±7.7 242.2±15.0 273.4±10.6 283.0±18.9工藝2高劑量組0.064 224.4±7.6 249.4±13.6 276.4±15.1 272.2±41.8阿托伐他汀鈣組0.005 220.6±11.2 238.6±7.2 263.4±13.7 276.0±16.0

表4 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)模型大鼠血清總膽固醇（TC）及血清甘油三酯（TG）的影響（±s,n=9-10）

表4 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)模型大鼠血清總膽固醇（TC）及血清甘油三酯（TG）的影響（±s,n=9-10）

組別劑量（/g·kg-1）動(dòng)物數(shù)/只TC（/mmol·L-1）TG（/第m1m2o天l·L-1）TG（/第m3m3o天l·L-1）正常對(duì)照組— 10 1.64±0.27 1.53±0.63 0.80±0.26模型組—10 4.90±2.41#4.15±1.06#0.56±0.31工藝1低劑量組0.016 9 3.97±2.38 3.57±0.61 0.58±0.17工藝1中劑量組0.032 10 3.11±2.46 3.63±0.69 0.56±0.27工藝1高劑量組0.064 10 2.89±1.56*4.67±1.71 0.51±0.21工藝2低劑量組0.016 10 3.21±1.36 6.05±0.96 0.57±0.16工藝2中劑量組0.032 10 3.24±1.78 2.79±0.92 0.50±0.20工藝2高劑量組0.064 9 2.91±1.54*4.86±1.55 0.68±0.33阿托伐他汀鈣組0.005 9 2.86±1.11*5.47±1.57 0.49±0.08

注：TG 第12 天檢測(cè)動(dòng)物數(shù)為5 只，第33 天檢測(cè)動(dòng)物數(shù)為9-10 只。與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。

2.6 肝組織超氧化物歧化酶活力SOD、還原型谷胱甘肽GSH和肝丙二醛MDA

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織SOD水平及還原型GSH含量明顯降低，MDA 含量明顯升高；連續(xù)33 天給予阿托伐他汀鈣（5 mg·kg-1）后模型大鼠肝組織SOD水平及還原型GSH含量明顯升高，MDA含量明顯降低。說(shuō)明模型建立成功。

與模型組相比，工藝1 高劑量組、工藝2 中劑量組及高劑量能顯著升高模型大鼠肝組織SOD水平、還原型GSH含量，工藝1高劑量組、工藝2高劑量組能顯著降低MDA 含量。其余劑量組未見(jiàn)明顯差異。具體數(shù)值（表6）。

表5 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)高脂血癥大鼠血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的影響（±s,n=9-10）

表5 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)高脂血癥大鼠血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的影響（±s,n=9-10）

注：與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。

組別劑量（/g·kg-1）動(dòng)物數(shù)/只LDL-C（/mmol·L-1）動(dòng)物數(shù)/只HDL-C（/mmol·L-1）動(dòng)物數(shù)/只FFA（/μmol·L-1）正常對(duì)照組--10 0.23±0.10 10 0.59±0.08 9 912.9±163.9模型組--10 1.16±0.58#10 0.27±0.10#9 1368.6±121.9#工藝1低劑量組0.016 9 0.94±0.66 10 0.31±0.09 9 1317.4±110.9工藝1中劑量組0.032 9 0.75±0.54 10 0.34±0.16 9 1116.3±129.6工藝1高劑量組0.064 10 0.59±0.35*10 0.25±0.07 9 1098.7±123.7*工藝2低劑量組0.016 10 0.73±0.38 10 0.32±0.13 9 1313.1±88.9工藝2中劑量組0.032 9 0.63±0.44*10 0.29±0.09 9 1101.9±155.4工藝2高劑量組0.064 9 0.66±0.34*9 0.32±0.14 9 1016.8±142.0*阿托伐他汀鈣組0.005 9 0.62±0.26*10 0.26±0.10 9 842.0±108.4*

2.7 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平

高脂高膽固醇飼料飼喂33天后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT 和AST 水平未見(jiàn)顯著差異。提示本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型未表現(xiàn)出明顯的肝損傷。

與模型組相比，給藥33 天后各給藥組大鼠血清ALT和AST水平未見(jiàn)明顯差異。具體數(shù)值（表7）。

3 討論

本研究采用的高脂血癥模型是用于評(píng)價(jià)或篩選降血脂藥物常用的模型，通過(guò)飼喂高脂高膽固醇飼料，使大鼠的脂質(zhì)代謝發(fā)生異常，表現(xiàn)為血清TC 和LDL-C的含量升高，HDL-C 的含量降低[16,17]。這種模型更接近于人類(lèi)高脂血癥的發(fā)病過(guò)程，并且條件溫和、重復(fù)性好。同時(shí)，文獻(xiàn)資料證明，降低血脂有多種途徑，其中一種就是通過(guò)清除體內(nèi)自由基，減少細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)

注：與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。

表7 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)高脂血癥大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響（±s,n=9-10）

表7 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)高脂血癥大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響（±s,n=9-10）

組別劑量（/g·kg-1）動(dòng)物數(shù)/只ALT（/U·L-1）AST（/U·L-1）正常對(duì)照組— 10 28.2±10.8 107.7±33.5模型組—10 38.8±25.6 124.8±35.1工藝1低劑量組0.016 10 46.4±34.5 140.9±58.9工藝1中劑量組0.032 9 56.9±47.3 172.3±88.6工藝1高劑量組0.064 10 43.9±28.4 107.6±14.9工藝2低劑量組0.016 10 42.9±40.9 144.2±75.7工藝2中劑量組0.032 10 34.3±32.9 129.0±88.2工藝2高劑量組0.064 9 47.9±46.9 166.2±99.3阿托伐他汀鈣組0.005 10 40.2±25.2 115.8±41.4

表6 絞股藍(lán)總甙提取物對(duì)高脂血癥大鼠肝組織SOD、GSH及MDA水平的影響（±s,n=5）氧化而達(dá)到降血脂的目的。而絞股藍(lán)總皂甙可以顯著提高機(jī)體SOD、GSH 的活性，抑制MDA 的產(chǎn)生和/或加快其清除，從而有效的防治機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，能改變機(jī)體脂代謝的紊亂，調(diào)適機(jī)體的脂蛋白[18]。所以本研究同時(shí)檢測(cè)TC、TG 和LDL-C、SOD、GSH 和MDA等指標(biāo)，評(píng)價(jià)絞股藍(lán)總甙的降血脂作用。

通過(guò)結(jié)果可知絞股藍(lán)總甙提取物工藝1高劑量連續(xù)33 天給藥可降低模型大鼠血清TC、FFA、LDL-C 水平和肝臟MDA 含量，升高肝臟還原型GSH 的水平和SOD 的水平。工藝1 中、低劑量連續(xù)給藥33 天未表現(xiàn)出明顯的降血脂作用。而絞股藍(lán)總甙提取物工藝2高劑量連續(xù)33 天給藥也可降低模型大鼠血清TC、FFA、LDL-C 水平和肝臟MDA 含量，升高肝臟還原型GSH的水平和SOD的水平。工藝2中劑量也可降低模型大鼠血清LDL-C 水平，升高肝臟還原型GSH 的水平和SOD的水平。可知兩種工藝的絞股藍(lán)總甙都有降低血脂的作用，工藝2 的藥效要略?xún)?yōu)于工藝1，這為絞股藍(lán)總甙的工藝優(yōu)化提供科學(xué)基礎(chǔ)，下一步將開(kāi)展絞股藍(lán)皂甙代謝組學(xué)的相關(guān)研究，找出其差異性的代謝物，揭示絞股藍(lán)總甙降血脂的作用機(jī)制。

本研究提示，由于絞股藍(lán)中含有的皂苷種類(lèi)數(shù)量眾多，不同制備工藝方法對(duì)絞股藍(lán)皂苷的種類(lèi)、含量和組成比例影響較大，而這也直接影響其藥效。為保證絞股藍(lán)總甙能更好的發(fā)揮功效，確保人們用藥安全、有效、穩(wěn)定可靠，有必要從藥理藥效方面著手，制定其工藝優(yōu)化方案。