基于“有效成分—性狀”的關聯分析評價丹參品質的研究＊

王 蕓，陳軍峰，張 磊，陳萬生＊＊

（1.第二軍醫大學附屬長征醫院 上海 200433；2.上海中醫藥大學中藥資源與生物技術中心上海 201203；3.第二軍醫大學藥學院 上海 200433）

性狀鑒定是中藥鑒定的主體，“辨狀論質”是傳統中藥鑒定的精髓與總結[1,2]。“辨狀”即辨藥材的外觀：形、色、氣、味、表面特征、質地、斷面特征等，“論質”則是由“狀”的差異來判斷藥材的真偽優劣[2]。在中藥材質量優劣評價方面，市場流通過程中依舊遵循著“看貨評級，分檔議價”的古法，即依照中藥材商品規格對中藥材進行定檔定價。我國自建國以后共頒布過三次中藥材商品規格標準，分別是1954 年頒布的《38 種藥材商品規格標準》，1964年頒布的《54種藥材商品規格標準》以及現行的由國家醫藥管理局和衛生部于1984年聯合頒布的《76種藥材商品規格標準》[3,4]。

本研究以常用大宗藥材丹參為對象，以現代科學對中藥材“辨狀論質”的科學內涵進行探索。丹參（Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma），作為臨床常用大宗藥材，在生產和市場流通過程中，其品質評判主要依據兩類評價體系：一類是以“辨狀論質”為核心的性狀鑒定，即依據性狀的差異建立“商品規格”從而對丹參的品質進行評價，該方法簡單易行、直觀明了，在產地、市場流通中廣泛應用，但是主觀性強，缺乏可量化標準；另一類評判體系即國家標準，依據《中國藥典》（2015 版）要求，測定指征性活性成分的含量（丹酚酸B ＞3%，總丹參酮＞0.25%）來判定丹參是否合格，藥典標準科學、準確，但是實施條件要求較高，難于在丹參藥材的生產和流通的各個環節普遍應用。兩種評判體系與依據各具優勢，然而，兩類體系是否一致，能否相互印證，并未有相關研究報道。此外，兩個評價體系一致或不一致的內在機制為何，解釋以上問題，才能闡明丹參“辨狀論質”理論的科學內涵。基于以上問題，本研究對兩種丹參品質評判體系進行進一步深入解析，利用植物表型組研究策略，建立和補充，闡明丹參藥材“辨狀論質”的科學內涵，以此促進中藥傳統性狀鑒定的持續發展。

1 材料與方法

1.1 儀器

高分辨率透射掃描儀（UMAX PowerLook 2100XL，臺灣）；安捷倫1200A-6410A 型三重四級桿串聯質譜儀（安捷倫，美國）；安捷倫1290A-6538A型四極桿-飛行時間質譜儀（安捷倫，美國）；質譜數據分析使用MassHunter（Ver.B.01.04及B.07.00）；安捷倫ZORBAX SBC18色譜柱（2.1×100 mm，3.5 μm）（安捷倫，美國）；沃特世XSELECT CST-C18色譜柱（2.1×50 mm,2.5 μm），沃特世ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）（沃特世，美國）；WinRHIZO rootscan（Ver2015）植物根系高分辨率掃描分析系統（WinRHIZO，加拿大）。

1.2 試藥

丹參酮ⅡB、紫丹參甲素、丹參二醇B、紫丹參萜醚標準品（純度≥98%）：云南西力生物技術有限公司；丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮和華法林標準品（純度≥98%）：上海源葉生物有限公司。

1.3 植物材料

研究所用丹參樣品均為陜西商洛丹參GAP 基地的栽培丹參。

1.4 丹參樣品處理

采挖新鮮丹參后在不破壞根系表面結構的情況下簡單迅速處理掉表面泥沙等雜質后，統一以主根（或母根）與莖相交處上方（形態學）1-3 cm 處作為檢測材料。按長度比將材料均分為兩部分，選擇靠近根尖的部分置于固定液中進行保存后續用于制作石蠟切片；另一部分的厚片沿橫切面直徑均分作2 份，一份不做處理，另一份則拆分為周皮，皮層+韌皮部、木質部用作有效成分含量測定。

將已完成上述處理的丹參樣品自然干燥；將干燥后的樣品，以游標卡尺測定主根中上部直徑，以高分辨掃描儀采集根表面圖像，Image J獲取丹參全區域內表面顏色的色度值。

1.5 丹參藥材的定檔分級

目前在市場中使用的中藥材商品規格依舊是1984年頒布的《76種藥材商品規格標準》，以其中所收錄的“家種川丹參的標準”作為丹參樣品的定檔標準，以采收自陜西商洛的102株丹參樣品作為測試材料進行定檔分級。

1.6 丹參主要活性成分的含量測定

以LC-MS/MS 技術完成酚酸類成分—丹酚酸B、丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸A，丹參酮類成分—丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮（TSN IIA，TSN I，CTSN，DHTSN）的含量測定，同時以UHPLC-Q-TOF/MS的方法實現25類丹參酮類成分的相對定量分析[5,6]。

1.6.1 LC-MS/MS技術定量測定主要酚酸類成分

色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-C18 色譜柱（2.1×100 mm,3.5 μm）；流動相為2 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫：7%乙腈（0-2 min），7%-95%乙腈（2-3 min），95%乙腈（3.5-8 min），后運行時間6.5 min；流速0.3 mL·min-1；進樣量：5 L；柱溫35℃。

質譜條件：離子源為電噴霧離子源；離子化模式為負離子模式；離子源溫度105℃；干燥氣和霧化氣為氮氣，干燥氣溫度350℃，流速10 L·min-1；霧化壓力40 psi；離子噴霧電壓4000 V；碰撞氣為高純氮氣，壓力0.1 MPa。目標化合物檢測采用多反應監測模式（Multiple reactions monitoring mode，MRM）。

對照品和供試品溶液的配制：對照品分取1 mg配成終濃度1 mg·mL-1的母液，用甲醇稀釋各儲備液配制成酚酸類成分標準系列工作液。供試品材料適量磨粉過100 目篩，分取0.1 mg 粉末置于10 mL 容量瓶，加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，冷卻后補足失重。取100 L提取液于35℃，2000 rpm轉速下揮干，10倍體積復溶，復溶液于4℃離心30 min后分取上清作為供試品溶液。

1.6.2 LC-MS/MS技術定量測定主要丹參酮類成分含量

色譜條件：色譜柱為沃特世XSELECT CST-C18色譜柱（2.1×50 mm,2.5 μm）；流動相為2 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸-乙腈，60%乙腈等度洗脫，洗脫時間5 min；流速0.3 mL·min-1；進樣量：5 L；柱溫35℃。

質譜條件：離子化模式為正離子模式；其余同上。對照品和供試品溶液的配制同上。

1.6.3 UHPLC-Q-TOF/MS 技術相對定量測定丹參酮類成分

色譜條件：色譜柱為沃特世ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 X 100 mm，1.8 μm）；流動相：0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫，流動相為0.2%甲酸-乙腈，梯度洗脫：5%-95%乙腈（0-20 min），后運行時間3 min；流速0.3 mL·min-1；進樣量：3 L；柱溫30℃。

質譜條件：采用雙噴流電噴霧離子源，正離子模式掃描，以高純氮氣作為霧化電離氣，設置干燥氣溫度350℃，流速11 L·min-1，霧化氣壓45 psi，鞘氣溫度、流速設置與干燥氣相同，毛細管電壓4 kV，碎片電壓120 V，錐孔電壓60 V，采集范圍為100-1700 m·z-1。儀器使用前以調諧液對儀器進行校正，使用過程中不間斷加入參比液進行質量校準。

對照品和供試品溶液的配制：精密稱取內標化合物華法林標準品1 mg 置1 mL 容量瓶內加入甲醇配制成濃度為1 mg·mL-1溶液作標準內標儲備液。用甲醇稀釋儲備液至終濃度為20 ng·mL-1作內標溶液；其余標準品溶液處理同上。

1.7 丹參商品規格等級同活性成分的關聯分析

丹參定級后，分別以藥典中規定的指征性活性成分：丹酚酸B 和總丹參酮含量為統計參數，以SPSS 21.0軟件對不同等級樣品中的活性成分含量進行正態性分布檢驗，，將符合正態性分布的活性成分含量以完全隨機設計的單因素方差分析（ANOVA）進行統計分析。同時將測定的活性成分含量結果以log10 算法進行歸一化處理，以SIMCA-P V11.5.0 Demo對均一化的數據進行主成分分析考察群體樣本間的離散情況。

表1 丹酚酸和丹參酮類成分MRM參數。

表2 相對定量測定的丹參酮類成分列表。

1.8 丹參樣品的重新分級

嚴格按照《中國藥典》（2015 版）中丹參指征性活性成分的含量限度要求，對已完成含量測定的丹參樣品進行重新分組。本批樣品中丹酚酸B的含量遠高于藥典標準，故最后僅以總丹參酮的含量作為分組標準。按照藥典規定的總丹參酮含量不得低于0.25%的限度要求將現有丹參材料分為合格組和不合格組，合格組總丹參酮含量不低于0.25%，不合格組總丹參酮含量低于0.25%。

1.9 丹參根系結構特征的研究分析

根系在不破壞整體結構的條件下，清洗去除泥沙等雜質后經WinRHIZO系統配備高分辨率掃描儀進行掃描獲得高分辨率圖像（300 dpi），然后圖像經WinRHIZO和ImageJ軟件獲得丹參根系結構特征參數[7-10]。

將保存在固定液中的丹參厚片制作成石蠟切片并經番紅固綠染色，染色切片經高通量快速切片掃描儀掃描后，使用Pannoramic Viewer對切片進行圖片獲取，根據統一比例尺(2000 M)調整切片圖像尺寸，然后圖像經RootScan軟件依次識別皮層組織、木質部結構，完成各類細胞識別計數，獲得丹參根系組織分布特征數據[8]。

1.10 構建丹參根系“表型-化學特征”關聯性分析

首先對數據進行預處理。對于數據嚴重缺失的參數可以采用手動去除，對于無法判斷的參數本研究采用格拉布斯（Grubbs'test）檢驗進行異常值的篩選，將組內單一植物樣品的每個性狀參數進行假定正態分布分析（Assumption of normal distribution），將離群值所指征的表型特征刪除，并進行迭代測試直到無異常值存在。而后基于皮爾斯相關系數（Pearson Correlation Coefficient）構建有效參數的“表型-化學特征”相關性網絡。

1.11 擬合丹參品質評價模型

隨機篩選合格組和不合格組內各2/3的樣本設為測試集，以二元Logistic回歸統計分析的方法建立品質評價模型，以驗證集驗證該模型。

1.12 丹參活性成分組織分布特異性研究

以LC-MS/MS的方法測定拆分后丹參各組織結構中的主要活性成分含量，用log10 算法對丹參樣品中主要活性成分的含量進行歸一化處理，經主成分分析和層次聚類分析后獲得丹參根系主要活性成分的分布差異情況。

2 結果與分析

2.1 丹參藥材的定檔分級結果

嚴格按照商品規格標準將丹參樣品材料分為一等品、二等品和等外三個規格，其中一等品39 個，占比38.24%，二等品59 個，占比57.84%，等外4 個，占比3.92%。

2.2 丹參商品規格等級同活性成分的關聯分析

統計分析結果顯示一等品中丹酚酸B和總丹參酮含量均略高其他等級，但不同等級間樣品并不存在顯著性差異（圖1-A，B）。主成分分析結果顯示對于丹參酮類成分，無論是以藥典中規定的丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ和隱丹參酮作為分析指標，抑或是增加分析指標，以相對定量測定的25種丹參酮類成分作為分析指標，不同等級間樣品均無法實現聚類（圖1-C，D，E）。與上述結果相似，以丹酚酸類成分—丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸、丹參素鈉作為分析指標，不同等級間樣品同樣無法實現聚類（圖1-F）。

上述研究結果表明現行的商品規格標準存在一定的局限性和不合理性。為了對現行商品規格標準進行補充，我們以藥典中所規定的指征性活性成分含量作為分級標準對丹參樣品進行重新分級，然后以單一性狀特征或多個性狀特征連鎖分型同活性成分構建相關性分析，發現真正具有品質指征作用的關鍵性狀，最后通過擬合評價模型驗證性狀的品質指征作用。

圖1 不同商品規格等級丹參樣品的活性成分含量差異情況

2.3 丹參樣品的重新分級結果

圖2顯示丹參樣品中丹酚酸B的含量遠高于藥典標準，故僅以總丹參酮的含量作為分組標準。重新分組標準為合格組總丹參酮含量不低于0.25%，不合格組總丹參酮含量低于0.25%。重新分組結果為合格組共計90 個，占比88.24%，合格組共計12 個，占比11.76%。

2.4 構建丹參根系“表型-化學特征”關聯性分析

圖2 丹參樣品中丹酚酸B（LAB）（A）和總丹參酮（B）含量分布散點圖

圖3 丹參根系表型與代謝物累積相關性網絡

圖4 擬合評價模型的ROC曲線

表4 驗證集內丹參樣品重新分組結果

通過數據預處理共剔除異常參數31項，所剔除參數均為表型參數。而后構建有效參數的“表型-化學特征”相關性網絡。構建的“表型-化學特征”相關性網絡（圖3）顯示共有49個參數間具有顯著相關性（P ＜0.05），其中表型參數33個，化學參數16個，共呈現390組關聯，343 組關聯為正相關，47 組為負相關，其中極顯著關聯（P ＜0.01）188組，多發生在表型特征參數之間。利用Cytoscape 軟件對關聯性進行關聯性網絡可視化構建，發現整個網絡可以明顯分為兩個聚類，表型參數可分為一類，化學特征參數可分為一類。其中個別表型參數，不僅與其他表型參數具有顯著關聯性，同時也與化學特征參數之間具有顯著關聯性，表明該表型特征與活性成分含量水平具有一定的關聯性，可以作為具有品質指征性作用的候選性狀。與活性成分具有極顯著差異的表型特征有6 個，分別是與丹參酮I、丹參酮IIA、和隱丹參酮的含量具有正相關性的紅色色度值（Red），與丹參酮I的含量具有正相關性的綠色色度值（Green），與丹參酮I、二氫丹參酮的含量具有正相關的平均色度值（（R+G+B）/3）；與丹參酮I、丹參酮IIA和迷迭香酸的含量具有負相關的主根最大直徑（Maximum Diamater of MR，MD）；與丹酚酸B含量具有負相關，但與丹參酮IIA、的含量具有正相關的形成層外區域占比（RatioCtoXS）以及與丹酚酸B 含量具有負相關，但與丹參酮I、隱丹參酮的含量具有正相關的形成層外內面積比（RatioCtoS）。其中形成層外內面積比以及形成層外區域占比在生物學意義上具有重復性，故僅只以最大直徑、色度值（Red、Green、R+G+B）/3）、切面形成層外內面積比作為具有品質指征性作用的候選性狀。

2.5 丹參品質評價模型

以最大直徑、色度值（Red、Green、R+G+B）/3）、切面形成層外內面積比作為模型參數以二元Logistic回歸統計分析的方法建立品質評價模型，獲得經過logit轉換的公式如下：

利用得到的預測概率P 值進行ROC 曲線分析（圖4），其曲線下面積為0.703，P ＜0.05，敏感度87.5%，特異性55.0%，表明該模型具有一定的準確性。以驗證集驗證該模型，將驗證集內樣品按上述評價模型重新分組（表4），其中原合格組內樣品重新分組后的合格率為69.2%，原不合格組內樣品重新分組后的不合格率為66.7%，即該模型驗證后對于合格組和不合格組而言其匹配度分別為69.2%和66.7%。上述匹配結果表明該模型具有一定的準確性，所挑選的關鍵性狀具有品質指征作用。

進一步分析篩選出來的關鍵性狀特征，發現最大直徑、根系表面色度值、切面形成層外內面積比均為切面特征或切面相關特征。切面特征是中藥傳統鑒定中的一個重要指標，是傳統性狀鑒定的重要判斷依據。在已有的中藥材性狀研究中發現主要有效成分多分布在薄壁細胞中，薄壁細胞較多的結構所占比例越大，相應的有效成分量越高，甚至可以表現出某些質地特征[3]。所以通過解析活性成分的組織分布特異性可以實現對關鍵性狀特征形成機制的探索。

2.6 丹參活性成分組織分布特異性

丹參樣品中主要活性成分的含量歸一化處理后經主成分分析和層次聚類分析獲得丹參根中主要活性成分的組織分布差異情況。結果（圖5）顯示，不同組織結構樣本表現出較明顯的聚類和分離，無論是酚酸類成分或是丹參酮類成分，總體均可以分為兩個集合簇，其中周皮樣本（圖中以綠色表示）聚類在一起，而木質部和韌皮部樣本（圖中藍色表示木質部樣本，紅色為韌皮部+皮層樣本）混合聚類在一起。結果提示我們造成上述聚類結果的原因可能是丹參不同組織中活性成分種類和含量有所差異。故進一步以層次聚類分析的方法來解釋上述結果。熱圖（圖6）顯示不同種類的活性成分的組織分布特異性，結果表明丹參酮類和酚酸類兩類化合物具有明顯區別的組織分布規律：以丹酚酸B 為代表的酚酸類在根的各組織結構中均有分布，但在木質部和韌皮部中的含量遠高于周皮層內，與之不同的是丹參酮類成分則主要分布在周皮層。

同時，根據已發表丹參轉錄組數據（Accession：SRX753381，SRR1640458，SRP028388，SRP051564），分析丹參各組織結構中參與丹參酚酸類途徑和丹參酮類途徑的關鍵通路基因的轉錄變化情況，發現參與MEP 途徑的關鍵酶基因SmDXSs、SmDXR、SmMCT、SmCMK、SmMDS、SmHDS、SmHDRs、SmIPI 和SmGGPPSs，參與MVA 途徑的關鍵酶基因SmAACTs、SmHMGSs、SmHMGRs、SmMK、SmPMK、SmMDCs、SmIPI、和SmGGPPSs以及丹參酮合成途徑的關鍵酶基因SmCPS1、SmKSL1 和CYP76AH1 主要在周皮層富集表達，而參與酚酸類途徑的關鍵酶基因SmPALs、SmC4Hs、Sm4CLs、SmTATs、SmHPPRs、SmRASs 和SmCYP98A78 在周皮層中的表達量相對較低，而主要于木質部和韌皮部內相對高表達[11,12]。基因轉錄表達結果與代謝檢測結果具有一致性，證明了丹參酮類和酚酸類兩類化合物的組織特異性形成主要是由于活性成分合成部位具有組織特異性而非轉運機制的參與。

圖5 丹參主要酚酸類成分（A）和丹參酮類成分（B）的組織分布差異

圖6 丹參不同組織結構中主要活性成分的分布差異熱圖

以活性成分組織特異性的規律來探索關聯性的內在機制：丹參酮類化合物多呈橘紅色，大量積累在周皮結構，使根呈現紅色，所以“色越紅”表明該原藥材中含有的丹參酮類成分含量越高；根越粗，相應的根比表面積值會減小，周皮結構相對體積減小，導致丹參酮類成分的含量水平降低；形成層內外面積比影響的各組織結構的相對比例，從而影響丹參酮的含量。

3 總結與討論

傳統中藥的“辨狀論質”是在上千年中藥材使用過程中得出的經驗總結，合理性與局限性并存，利用現代科學闡明其科學內涵并進行修正，是科學合理地傳承“辨狀論質”的必由之路。“辨狀論質”的科學內涵即利用科學手段解釋中藥“狀”與“質”直接的關聯。鑒于中藥的品種、性狀特征、應用部位等存在復雜的多樣性，長期以來并未形成系統性的研究體系，主要問題在于難以將性狀特征進行高效準確的量化和分析，同時無法有效地構建性狀特征與有效成分累積之間的關聯[3]。本研究針對丹參根系為藥用部位的特點，利用植物表型組學的概念，嘗試探究丹參藥材品質的內涵，為建立合理可行的丹參商品規格標準提供參考。

首先，我們以活性成分為評判標準，比較現行丹參藥材的“商品規格”和《中國藥典》（2015 版）規定的丹參藥材標準是一致。結果顯示，簡單的依據尺寸、形態來分級的“商品規格”并不能完全準確地反映出藥材的活性成分水平，從而難以準確反映其藥效物質基礎。此外，不難想象，除了丹參，這種商品規格與藥材真實品質不一致的狀況必然在其他藥材中普遍存在。可見，有必要找尋出性狀特征與活性成分，與藥效的相關性。

為了發現能夠明確指征丹參品質的形態特征，針對丹參藥材的特性，本研究整合了多種植物根系形態分析的軟件，經過篩選，可以快速獲取丹參藥材的形態特征參數。利用高通量的圖像分析可以獲得多種形態特征參數，極大地提高參數獲得的速度和準確度，同時，還可以獲得許多通過手工測量或者直接觀察無法獲得的數據，比如預測根系的總表面積、組織分布比例、根系結構等參數。結合代謝分析，構建形態參數—活性成分的關聯網絡，進而篩選出關鍵特征，用以擬合丹參品質評價模型。雖然該模型尚待通過大量樣本的糾正以及驗證，且從理論到實際應用尚存在很長的距離，但本研究依然為中藥材“辨狀論質”科學內涵研究提供了研究新思路和新方法，以多科學手段討論藥材的質量，更可進一步對藥材的質量標準或是商品規格的指定提供參考。