超高效液相色譜-串聯質譜法快速同時測定生姜中10種營養成分

張文煥, 劉平香, 邱 靜, 賈 琪, 錢永忠

(中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所, 農業農村部農產品質量安全重點實驗室, 北京 100081)

生姜是人們日常生活中的重要調味品之一,在我國及世界各地均有廣泛種植,其品種多樣,具有特殊的營養保健功效,是“藥食同源”的典型代表[1]。生姜中的姜辣素類化合物是其特殊辛辣味的主要來源,它們是一類結構、性質類似的物質,其中含量最高的是姜酚類物質,包括6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚等,還含有少量6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚等姜烯酚類物質。從結構上看,它們都有3-甲氧基-4-羥基苯基官能團,姜酚類化合物中還有性質活潑的β-羥基酮結構,這使得生姜具有較強的生物活性[2-4]。研究表明,姜烯酚比姜酚更辛辣,且生物活性更高[5]。生姜中的姜黃素類化合物是其重要的呈色物質,如姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素,它們是自然界中稀有的二酮類天然色素,廣泛存在于姜科類植物中[6]。研究表明,包括四氫姜黃素在內的姜黃素類化合物同樣具有顯著的生物活性,有報道指出四氫姜黃素的生物活性優于姜黃素[7]。此外,生姜中還存在一類揮發性精油物質,它們在鮮姜中含量豐富、種類繁多,一同決定了生姜的氣味[8],而香氣成分容易揮發,結合生姜的儲藏特性和食用特性,生姜的特征營養成分當以姜辣素類和姜黃素類物質為主。大量研究表明,由于生物活性物質的存在,生姜不僅有抗菌、鎮痛、止嘔、止暈、抗炎、抗癌、抗氧化、降血糖血脂等重要生理作用,還可用于研制治療心腦血管疾病、風濕性關節炎、胃潰瘍等疾病的藥物和保健食品[9-13]。

生姜品質主要取決于其含特征營養成分的量,在多國藥典中已將6-姜酚的含量作為評價生姜質量的關鍵指標之一[14]。近年來,生姜中化學成分的測定方法已有較多報道,針對營養成分的檢測大多是針對某一物質或某一類物質開展的,如Park等[15]采用高效液相色譜-飛行時間質譜(HPLC-TOF/MS)方法對生姜中姜辣素類化合物進行了定性篩查和定量測定,并在60 min內鑒定19種姜辣素類化合物,其中6-姜酚含量最高,10-姜酚、8-姜酚次之;Jadhav等[16]和Jayaprakasha等[17]分別建立了HPLC方法對3種姜黃素類化合物同時測定。然而,同時檢測兩類營養成分的方法未見報道。鑒于生姜中姜辣素類和姜黃素類化合物具有相似的結構特征和功能活性,有必要建立一種同步、快速測定二者的分析方法。

本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)對生姜中含量較高、活性較強的6種姜辣素類化合物和4種姜黃素類化合物進行了測定,以期在實際樣品的檢測中得以應用,并為進一步研究生姜中營養成分的變化規律、品質鑒別及資源開發利用提供必要的技術手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀(包括Agilent 1290 InfinityⅡ高效液相色譜儀和Agilent 6470 Triple Quad LC/MS三重四極桿質譜儀,美國Agilent公司); Milli-Q去離子水發生器(美國Millipore公司); E0301平行研磨儀(中國天津阿爾塔科技有限公司); XSE105 Dual Range分析電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); SCDEALL VX-Ⅲ Multi-Tube Vortexer多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司);甲醇和乙腈(質譜級,德國Merck公司);甲酸(質譜級,美國Sigma-Aldrich公司)。

標準品:6-姜酚(6-gingerol, CAS號:23513-14-6,純度98.9%)、8-姜酚(8-gingerol, CAS號:23513-08-8,純度99.5%)、10-姜酚(10-gingerol, CAS號:23513-15-7,純度97.5%)、6-姜烯酚(6-shogaol, CAS號:555-66-8,純度97.6%)、8-姜烯酚(8-shogaol, CAS號:36700-45-5,純度98.3%)、10-姜烯酚(10-shogaol, CAS號:36752-54-2,純度98.1%)、四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin, CAS號:36062-04-1,純度99.7%)、姜黃素(curcumin, CAS號:458-37-7,純度98.9%)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin, CAS號:22608-11-3,純度98.0%)、雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin, CAS號:24939-16-0,純度98.0%),均購于天津阿爾塔科技有限公司。10種標準品的化學結構式見圖1。

圖 1 10種營養成分的化學結構式Fig. 1 Chemical structures of the 10 nutrients

實驗用生姜樣品采自山東省各生姜基地,收獲期均為2018年11月。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取5.0 mg 10種營養成分標準品(精確至0.1 mg),用甲醇定容至5 mL,配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液,于-20 ℃冰箱儲藏,備用。

吸取適當體積的各標準品儲備液,用甲醇稀釋,配制成質量濃度為10 mg/L的混合標準中間溶液,于-20 ℃冰箱儲藏,備用。

用甲醇稀釋混合標準中間溶液,配制成質量濃度為0.10～200 μg/L的混合標準工作溶液,現用現配。

表 1 10種營養成分的質譜參數

1.3 樣品預處理、前處理

預處理:選取形態完整、質量約200 g的塊狀生姜根莖作為實驗樣品,去除泥土,用水洗凈,拭干表面;不去皮切成小塊,裝入研磨杯,使用平行研磨儀充分研磨,然后轉移至塑封袋中,于-20 ℃保存,待用。

前處理:稱取(500±0.5) mg生姜樣品的均一研磨物,置于50 mL具塞離心管中,加入25 mL甲醇,封蓋,渦旋10 s,短暫混合,置于渦旋振蕩器,提取2 min,靜置10 min,取1 mL上清液,過0.2 μm有機濾膜。由于樣品中某些營養成分含量非常高,需用甲醇逐級稀釋配制成不同稀釋倍數的系列樣品溶液,以備上機測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～2.5 min, 5%B～40%B; 2.5～4.5 min, 40%B～85%B; 4.5～4.6 min, 85%B～5%B; 4.6～5.5 min, 5%B。進樣量:2.0 μL。

1.5 質譜條件

離子源:噴射流離子聚焦-電噴霧電離(Jet Stream ESI)源;離子模式:正離子模式;掃描方式:多反應監測(MRM)模式;鞘氣溫度和流速:250 ℃和11.0 L/min;噴嘴電壓:500 V;毛細管電壓:4 000 V;霧化氣壓力:0.31 MPa;干燥氣溫度和流速:300 ℃和5 L/min;以上干燥氣、霧化氣、碰撞氣、鞘氣均為高純氮氣(N2)。

10種營養成分的監測離子對信息、碎裂電壓(fragmentor)和碰撞能(collision energy)等質譜參數見表1。

表 1 (續)

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

采用了噴射流離子聚焦-電噴霧電離源,該技術通過加熱鞘氣加速溶劑蒸發并降低離子逸散,從而提高離子生成及傳輸效率,增強質譜的離子采樣率,獲得更好的檢測靈敏度。在電噴霧電離條件下,采用正離子模式使目標分子較易獲得1個質子,從而形成穩定的[M+H]+準分子離子峰。

分別采用100 μg/L的單一標準溶液上機分析，確認每種目標營養成分的母離子和子離子。選擇一級質譜全掃描模式尋找母離子;選擇離子監測模式優化出母離子響應最佳時的碎裂電壓,以保證母離子的傳輸效率;選擇子離子掃描模式進行二級質譜全掃描,尋找響應最好的2～3個子離子,同時優化每個子離子響應較高的碰撞能;最后選擇多反應監測模式掃描,對碰撞能進一步優化,得到子離子響應最佳時的碰撞能。

其中值得注意的是,歐盟方法學標準對質譜方法定性確證的要求是滿足最低“4分法”,以每個母離子為1分,每個子離子為1.5分計[18],因此對LC-MS/MS而言,需至少有2對離子對方可實現對目標物的準確定性。在選擇子離子時,排除了相對分子質量小于50的離子以及中性丟失離子(如脫水離子)。在完成了母離子和子離子確認以后,采用自動優化程序和手動優化程序同時確證優化出最優的碎裂電壓與碰撞能。

10種目標營養成分的分子結構具有一定的相似性,如3種姜酚均具有典型的β-羥基酮結構,由電離結果發現,相似結構特征所產生的離子碎片呈現出一定的碎裂規律,如3種姜酚及四氫姜黃素均可產生信號較強的m/z為177.1和137.1的碎片離子峰,3種姜烯酚均可產生信號較強的m/z為137.1和m/z122.1的碎片離子峰,去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素均可產生m/z為147.0的碎片離子峰。在4種姜黃素類營養成分中僅四氫姜黃素能夠產生信號較強的m/z為137.1的碎片離子峰,同時僅雙去甲氧基姜黃素未能產生m/z為177.1的碎片離子峰。由此分析可知,可以通過選擇恰當的特征離子碎片從而鑒別推斷各物質的裂解規律,還可為生姜中更多具有相似結構功能的化合物的發現提供一定依據。

2.2 色譜條件的優化

液相色譜條件影響目標化合物的離子化效率,影響其色譜峰分離行為與峰形,為獲得理想的色譜分離效果和更高的檢測靈敏度與準確性,實驗對流動相組成、柱溫以及梯度洗脫程序進行了優化。選用常見的甲醇-水體系和乙腈-水體系作為流動相進行考察,發現在兩種流動相體系下各目標化合物均能出峰,但在甲醇-水體系下表現出更高的響應,故采用了甲醇-水體系。結合10種目標化合物具有較強極性的結構特點,在流動相中分別添加0.1%(v/v)甲酸有利于改善峰形。為使10種營養成分實現良好分離,采用梯度洗脫不斷調節流動相各部分比例,使得在1.4節梯度條件下,各目標物的色譜峰在5.5 min內實現較好分離。10種營養成分混合標準溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖見圖2。

圖 2 10種營養成分混合標準溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms of the 10 nutrients (50 μg/L) in the mixed standard solution

2.3 線性關系、檢出限和定量限

將10種營養成分的混合標準儲備液用甲醇稀釋配制成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和200.0 μg/L的系列標準工作液,以各營養成分的質量濃度為橫坐標(X, μg/L),色譜峰面積為縱坐標(Y)繪制標準工作曲線,進行線性回歸分析并計算相關系數(r),結果見表2。這10種營養成分的r為0.999 5～0.999 9,說明其線性關系良好,滿足檢測要求。

表 2 10種營養成分的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限

由于生姜樣品中本身含有待測物,且其中一些成分的本底值很高,因此不能獲得空白基質。對目標物檢測并計算信噪比(S/N)值,得出S/N均大于10,說明生姜中各目標物含量高于分析方法的定量限。考慮到實際應用中可能出現目標物含量接近或低于方法定量限等情況,故對方法的檢出限和定量限作進一步考察。將待測試樣稀釋100倍、1 000倍后,再檢測并計算S/N,以S/N大于3和大于10(同時符合回收率和精密度要求)確定10種目標物的檢出限和定量限,二者分別為0.04～2.02 μg/L和0.10～7.71 μg/L。10種營養成分的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限見表2。

2.4 回收率和精密度

由于生姜本身含有待測營養成分,無法得到空白基質樣品,為考察檢測方法的準確度和精密度,采用樣品加標回收法進行評價。取同一樣品的子樣兩份,一份不加標,另一份加入適量的10種營養成分的標準溶液,按1.3節和1.4節處理并上機測定,以二者測定結果的差值與理論加標值之比計算回收率。

因實際樣品中各營養成分的含量水平不一,需先明確各營養成分適合的樣品溶液稀釋倍數以及該稀釋倍數下的基質背景值,保證加標的量值與基質背景值接近,且不加標樣品與加標樣品的測定值都在線性范圍內。每種營養成分分別設置3個添加水平(見表3),每個水平平行測試6次,考察日內、日間精密度。實驗結果顯示,10種營養成分的平均加標回收率為82.8%～115.3%,相對標準偏差(RSD)為0.58%～11.49%,回收率和精密度良好(見表3)。

2.5 實際樣品測定

應用本方法測定生姜樣品56份。樣品于2018年11月采自山東省各市縣的生姜種植基地。通過繪制箱形圖對該批生姜樣品中各營養成分的含量進行分析,結果顯示,56份生姜樣品中10種營養成分均有檢出,并且它們的含量水平存在較大差別。生姜樣品中10種營養成分含量水平的離散分布結果見圖3。

該批生姜樣品中,6-姜酚的含量范圍為182.63～1 028.33 mg/kg,圖中四分位距表示6-姜酚含量的集中分布,范圍為373.35～702.48 mg/kg。總體上看,10種營養成分含量呈現出5個水平,分別是:6-姜酚為100～1 200 mg/kg;10-姜酚、8-姜酚為10～300 mg/kg;6-姜烯酚、四氫姜黃素為0.2～10 mg/kg;10-姜烯酚、8-姜烯酚、姜黃素、去甲氧基姜黃素為0.02～2.0 mg/kg;雙去甲氧基姜黃素為<0.02 mg/kg。本實驗結果說明生姜中姜辣素類營養成分的含量比姜黃素類的高。6種姜辣素中,姜酚(6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚)含量高于姜烯酚含量(6-姜烯酚、10-姜烯8-姜烯酚); 6-姜酚含量高于10-姜酚和8-姜酚;6-姜烯酚含量高于10-姜烯酚和8-姜烯酚。4種姜黃素中,四氫姜黃素的含量高于姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素,雙去甲氧基姜黃素含量相對最低。

表 3 生姜樣品中10種營養成分在3個加標水平下的平均回收率和RSD(n=6)

圖 3 生姜樣品中10種營養成分含量水平的離散分布Fig. 3 Discrete distribution of the contents of the 10 nutrients in ginger samples

3 結論

本文建立了一種超高效液相色譜-串聯質譜快速測定生姜中10種營養成分的分析方法。該法分析時間快,能夠實現對目標物的準確定性和定量,適用于生姜中姜辣素類和姜黃素類營養成分的同步分析,可為生姜的品質鑒定與質量控制提供技術手段。