兩步液液萃取-固相萃取凈化結合高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中11種磺胺類獸藥殘留

劉培勇, 張 惠, 米之金, 張良成, 張光仁

(達州市食品藥品檢驗所, 四川 達州 635000)

磺胺類(sulfonamides, SAs)藥物是一類用于治療細菌性感染疾病的廣譜抗菌藥,母核為對氨基苯磺酰胺,由此衍生出的化合物種類多達數千種,常用的有幾十種,因具有抗菌譜廣、高效、低毒、價格低廉等[1-3]特點,在臨床及獸藥領域應用十分廣泛[3-5],從而存在藥物濫用、誤用及不遵守休藥期規定等現象,造成很多動物源食品(水產品)中殘存磺胺類藥物及代謝產物;當這些代謝物在人體內積累到一定濃度時就會對人體的機能產生損害,破壞人體的造血系統,造成溶血性貧血,磺胺二甲基嘧啶等還存在潛在的致癌性[2]。據Baran等[6]報道丹麥在2009年每kg豬肉中磺胺類藥物的平均使用量為4.82 mg,經統計分析,磺胺類獸藥的使用量在所有肉類食品中處于中等偏上的水平,中國是豬肉消費大國,因此,加大豬肉中磺胺類獸藥殘留的日常監測十分必要。

隨著國內外檢測技術的不斷發展,目前磺胺類藥物的前處理和檢測手段越來越多,前處理手段除了傳統的液液萃取外,近年來出現了許多新的前處理方法,如固相萃取(SPE)法、超聲輔助分散液液微萃取法[7]、磁性多壁碳納米管法[8,9]、硅膠固載離子液體-基質固相分散法[10]、可視化蛋白質芯片法[11]、QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法[12],宋偉等[9]利用增強型脂質去除凈化劑(EMR)結合石墨化磁性多壁碳納米管作為QuEChERS法吸附劑對克氏鰲蝦進行前處理,測定了39種磺胺及喹諾酮類獸藥殘留,該方法為高脂肪含量的樣品基質提供了一種新的方法,并且取得了較好的凈化效果。液液萃取-固相萃取法是目前應用最廣的前處理方法,通過不同類型的SPE小柱基本能夠達到富集、凈化的目的,Economou等[13]、劉鐵錚等[14]、Wang等[15]采用不同SPE小柱分別對蜂蜜、雞蛋和雞肉基質中的磺胺做了加標回收試驗,平均回收率都在70%～106%。磺胺的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[16]、液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[17,18]、毛細管電泳法[19]、酶聯免疫法[20]。LC-MS/MS由于其靈敏度和選擇性都高于其他檢測器,目前被認為是效果最好的檢測方法,其他方法都因其特異性強、適用范圍窄且不適用于多類獸藥殘留的同時檢測[21]而受到很大限制。

但是目前采用LC-MS/MS測定磺胺類獸藥殘留最主要的缺點仍然是提取物脂肪、蛋白質含量高,基質效應明顯,尤其是一些新的方法,如QuEChERS法,在實現快速,高通量檢測的同時,固然節約了不少時間,但對于蛋白質含量高和基質更為復雜的樣品如肉類、動物肝臟等的應用還十分有限,共萃取物仍然具有脂肪和蛋白質等雜質含量高的缺點,會嚴重污染儀器,大大降低設備的靈敏度和使用壽命。液液萃取是一種最經典也是最成熟有效的提取方法,但是目前大多數都是采用單一溶劑多次提取或者極性相近的混合溶劑一步提取,采用極性相差較大的兩種有機溶劑分兩步提取在國內外仍然鮮有報道。本實驗優化了采用極性較強的乙酸乙酯、乙腈作為第一步提取溶劑,極性較弱的丙酮、二氯甲烷作為第二步提取溶劑,分兩步液液萃取磺胺的提取條件,并結合SPE凈化豬肉樣品,減少了基質效應,為采用HPLC-MS/MS測定動物源性食品中磺胺類藥物提供更加成熟有效的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6410A高效液相色譜-串聯質譜儀,配電噴霧離子源(ESI)(美國安捷倫科技有限公司); Milli-Q超純水機(美國Millipore公司); TGL20M湘立高速冷凍離心機(湖南湘立科學儀器有限公司); QF-3800氮氣吹干儀(天津旗美科技有限公司); GX-274 ASPEC全自動固相萃取儀(美國吉爾森公司); DMT-2500多管旋渦混合儀(北京中興偉業儀器有限公司); BUCHI GL45 Multivapor P-6濃縮蒸發儀(瑞士步琦公司); Oasis MCX固相萃取小柱, 60 mg, 3 mL(上海安譜有限公司)。

磺胺醋酰(sulfacetamide, SA)、磺胺嘧啶(sulfadiazine, SD)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SM1)、磺胺二甲嘧啶(sulfamerazine, SM2)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole, SMT2)、磺胺氯噠嗪(sulfachloropyridazine, SCP)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine, SMM)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)、磺胺異惡唑(sulfisoxazole, SIZ)、磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine, SDM)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline, SQX),均購于美國Sigma公司,純度≥99.6%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮,均為色譜純(德國Merck公司);無水硫酸鈉(用前需550 ℃灼燒6 h)、正己烷、正丙醇,均為分析純(成都市科隆化學有限公司); C18粉末(50 μm, 6 nm)(上海安譜有限公司);超純水(實驗用一級水);實驗用豬肉樣品來源于監督抽樣樣品。

1.2 標準溶液的配制

精確稱取11種磺胺類藥物標準品各0.002 5 g,用乙腈溶解并定容至25 mL,配成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液(磺胺喹惡啉需要加入0.1%(v/v,下同)甲酸助溶),置于4 ℃冰箱中避光保存。再精密吸取各儲備液于同一容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,配成質量濃度為1 μg/L的混合標準中間工作液。

稱取5份空白豬肉樣品,按照既定的提取方法制備空白基質溶液,用混合標準中間工作液加不同體積的空白基質溶液配成20、50、100、200、400 μg/L系列標準工作液,現配現用。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

準確稱取5.00 g(精確到0.01 g)均質樣品置于50 mL離心管中,加入5 g經灼燒的無水硫酸鈉和6 g C18粉末,混合均勻,加入20 mL含2%甲酸的乙酸乙酯,渦旋振蕩1 min,超聲提取10 min, 8 000 r/min離心5 min,將有機層移入濃縮瓶中,殘渣中再加入20 mL丙酮重復提取一次,合并轉入濃縮瓶中,加入10 mL正丙醇,于旋轉蒸發儀水浴45 ℃減壓濃縮至近干,氮氣流吹干,準確加入4 mL乙腈-水(1∶1, v/v)分兩次洗滌濃縮瓶,將洗滌液轉入氮吹管中,加入2 mL乙腈飽和過的正己烷溶液,渦旋振蕩1 min,靜置分層,棄去上層正己烷溶液,下層溶液待凈化。

1.3.2凈化

將MCX固相萃取小柱安裝于全自動固相萃取儀中,先用3 mL甲醇和3 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液活化小柱,將提取液倒入小柱中,然后分別用2 mL 0.1 mol/L鹽酸和2 mL水-甲醇-乙腈(55∶25∶20, v/v/v)洗滌小柱,用2 mL水-甲醇-乙腈-氨水(75∶10∶10∶5, v/v/v/v)洗脫藥物,收集洗脫液于45 ℃水浴氮氣吹干,用乙腈-水(1∶1, v/v)定容至1 mL,過0.22 μm微孔濾膜后,供LC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Thermo Accucore C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣量:5 μL。流動相:A為0.1%(v/v,下同)甲酸水溶液,B為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件:0～3 min,B由10%升至20%; 3～8 min,B由20%升至35%; 8～11 min,B由35%升至95%; 11～13 min, B由95%降至10%,保持2 min;分析時間:23 min。

1.4.2質譜條件

電離方式:電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;離子源溫度:100 ℃;檢測模式:多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓:4 000 V;脫溶劑溫度:350 ℃;脫溶劑氣流量:10 L/min;其余質譜參數見表1。

表 1 11種化合物的保留時間、監測離子對、毛細管出口電壓及碰撞能量

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 兩步液液萃取條件的優化

磺胺類屬于酸堿兩性化合物,不溶于非極性溶劑,但由于磺胺母體磺酰氨基的氮原子上含有兩個H,堿性較強,在酸性水溶液中,磺胺類呈電離狀態,溶解度也隨之增大,因此在前處理過程中向提取液中加入適量甲酸以增加磺胺類化合物的溶解性,從而提高萃取效率。經實驗發現,甲酸含量過低和過高都會導致磺胺的提取效率下降,一般添加量在1%～2%時回收率普遍較高,故本實驗選擇添加2%的甲酸。大部分研究僅采用單一溶劑或者混合溶劑一次提取,最常用的溶劑就是極性較強的乙腈、乙酸乙酯、水等。本實驗研究了采用極性較強的乙酸乙酯、乙腈作為第一步萃取溶劑,極性較弱的二氯甲烷、丙酮作為第二步萃取溶劑,同時比較了單純采用乙腈和乙酸乙酯作為萃取溶劑的提取效率,發現在第一步萃取劑選擇上,乙酸乙酯比乙腈對磺胺類化合物的選擇性要好,提取效率更高,同時,在第二步萃取溶劑選擇上,發現丙酮能顯著提高萃取效率,因此在乙酸乙酯提取后,再用等體積的丙酮提取,萃取效率提高了11.1%～66%,如圖1所示。這可能是因為丙酮能有效破壞SAs中氨基與基質蛋白質的氫鍵作用。故選擇先用乙酸乙酯溶液(含2%甲酸)萃取,再用丙酮溶液萃取。萃取溶劑的體積也會對提取效率產生不同程度的影響,本實驗在萃取總體積40 mL不變的條件下,對乙酸乙酯和丙酮的添加體積(1∶1、1∶2、2∶1)進行優化,結果表明,乙酸乙酯和丙酮的添加體積為1∶1(即分別添加20 mL)時,11種磺胺類藥物的回收率均在80%～120%之間(見圖1),回收率高,提取效果好。說明丙酮的量顯著影響磺胺與基質蛋白質相結合的氫鍵作用力。體積不足,導致不能完全破壞磺胺分子與基質蛋白質的結合氫鍵,體積過大,有可能會使更多基質蛋白質變性折疊,導致部分磺胺分子被蛋白質包埋。故本實驗最終選擇先用20 mL含2%甲酸的乙酸乙酯進行萃取,再用20 mL丙酮進行第二次萃取作為兩步液液萃取的條件。

圖 1 不同提取試劑、提取體積對磺胺類化合物回收率的影響Fig. 1 Effect of different extraction solvents and volumes on the recoveries of sulfonamides

2.2 儀器條件的優化

2.2.1色譜條件的優化

由于SAs在酸性條件下溶解性及穩定性較高,因此在流動相中加入甲酸;同時,甲酸有助于目標化合物在正離子模式條件下電離,提高目標物的響應值。試驗以0.1%甲酸水溶液作為流動相的A相,考察了B相分別為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇時,采用梯度洗脫程序對磺胺類藥物的分離情況。結果表明:采用與定容溶液一致的甲酸乙腈溶液作為流動相的B相時,可以獲得尖銳對稱的峰形,同時響應值也更高。圖2為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇作為B相時50 μg/L標準溶液的總離子流色譜圖(TIC)。采用乙腈時靈敏度比甲醇要高，峰形更好,故選擇0.1%甲酸乙腈為流動相的B相。圖3為50 μg/L標準溶液的MRM提取色譜圖。

2.2.2質譜條件的優化

采用正離子模式對11種磺胺類化合物進行分析,分子離子峰均為[M-H]+形式。為提高目標化合物的離子化效率及靈敏度,對質譜各參數進行了優化。采用不接色譜柱直接進樣,分別進行一級母離子掃描和二級子離子掃描,通過一級母離子掃描進一步確定各個化合物的母離子及去簇電壓(fragmentor)值,通過二級子離子掃描進一步確定各個化合物至少兩種響應值最高的子離子及每種子離子所需最佳的碰撞能(CE)。最后選定響應值最強、干擾最小的2個子離子作為定性離子和定量離子。通過對11種磺胺類化合物的二級子離子掃描發現,磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶的兩個特征離子都一樣,分別為m/z156、m/z108,可能因為所有磺胺類化合物母核均為對氨基苯磺酰胺,由于氨基的吸電子作用,使得苯環本身對磺酸基的吸電子能力減弱,導致磺酸基鍵在質譜碰撞能作用下容易斷裂,得到兩種比較固定的特征離子,這樣只需對一兩種磺胺類化合物的子離子CE進行優化,其他跟這些子離子一樣的磺胺類化合物無需再進行單獨優化,在此基礎上進行微調即可,這樣就大大縮短了子離子CE的優化時間。子離子的優化結果參數見表1。

圖 2 兩種B流動相條件下磺胺類藥物的總離子流色譜圖 (50 μg/L)Fig. 2 Total ion current chromatograms of sulfonamides with two B mobile phases (50 μg/L)

圖 3 11種磺胺類藥物的MRM提取離子色譜圖(50 μg/L)Fig. 3 MRM extracted ion chromatograms of the 11 sulfonamide drugs (50 μg/L)

圖 4 SPE凈化對各目標化合物的基質抑制率的影響Fig. 4 Effect of SPE purification on matrix inhibition rate for the target compounds

2.2.3基質效應(ME)

磺胺類藥物在質譜上的離子抑制效應很強,且基質對峰形干擾很大。本實驗通過測定基質匹配標準溶液和純溶劑標準溶液(50 μg/L)中各目標化合物的峰面積,采用兩者峰面積差值的絕對值與純溶劑標準溶液各目標化合物峰面積的比值來計算基質抑制率,從而評價基質效應[22]。比較了采用SPE小柱凈化與不凈化的基質抑制率,可以發現,經過SPE小柱凈化后的樣品基質抑制率要明顯低于未經凈化的(見圖4)。SA在未經固相萃取小柱凈化的情況下基質抑制率甚至高達60%,凈化后降至30%左右,而SQX卻基本不受基質效應的影響。目前降低基質效應的方法主要有制備基質匹配標準曲線、改進前處理技術、優化色譜條件以及控制流速等。所以,本實驗通過改進前處理條件,以兩步液液萃取結合固相萃取凈化方式降低基質干擾,同時采用基質匹配標準溶液繪制標準曲線以盡量消除基質干擾帶來的誤差。

2.3 方法學驗證

2.3.1線性范圍、線性方程、檢出限和定量限

精密吸取適量標準工作液用空白基質溶液分別配制成質量濃度為20、50、100、200、400 μg/L的標準工作系列,按本方法確定的條件分別進樣分析,以目標化合物的峰面積對其質量濃度繪制標準曲線。結果表明,在20～400 μg/L范圍內,11種磺胺類藥物均呈現良好的線性關系(相關系數(r2)≥0.99)。在陰性樣品中加標測定,以S/N≥3對應的最低加標水平作為方法檢出限,S/N≥10對應的最低加標水平作為定量限,結果見表2。

表 2 11種磺胺類藥物的線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.3.2加標回收率和精密度

本文對11種磺胺類獸藥進行了3個添加水平的加標回收試驗,每個添加水平做6次平行實驗,計算11種磺胺類藥物的3個不同水平的加標回收率及相對標準偏差(RSD),結果見表3。由表3可以看出,11種磺胺類獸藥的平均加標回收率為79.3%～105.5%,相對標準偏差為1.3%～11.6%,滿足獸藥殘留定性定量分析的要求。

2.4 實際樣品分析

采用本方法對2018年度抽樣的50批次鮮豬肉進行檢測,其中2批次檢出磺胺二甲基嘧啶,1批次檢出磺胺間甲氧嘧啶,含量分別為28 μg/kg、55 μg/kg和78 μg/kg。陽性檢出率為6%,雖然滿足了農業部235號公告規定所有動物肌肉所含磺胺總量不得超過100 μg/kg的規定,但是也說明我國獸藥濫用情況還是比較嚴重,人類長期食用還是會對身體健康造成一定的影響。

表 3 11種磺胺類藥物在3個加標水平下的回收率及RSD (n=6)

3 結論

本文利用丙酮能有效破壞磺胺分子中氨基與基質蛋白質的氫鍵作用,建立了一種通過采用兩種提取劑分兩步液液萃取對豬肉基質中11種磺胺類藥物的HPLC-MS/MS分析方法,克服了采用單一提取劑提取效率低的特點,同時結合固相萃取方法凈化,進一步減少了目標物質中的雜質干擾,降低了基質效應和對儀器的影響,提高了檢測的靈敏度,對改進豬肉中磺胺類獸藥殘留的液相色譜-串聯質譜方法的前處理技術有較高的參考價值。