高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉中3-甲基喹喔啉-2-羧酸殘留

魏敏芝, 萬建春, 張富生, 潘 華*

(1. 江西省農產品質量安全檢測中心, 江西 南昌 330012; 2. 江西省食品檢驗檢測研究院, 江西 南昌 330001)

喹乙醇是廣譜抗菌藥物,對革蘭氏陽性和陰性菌都有抑制作用,尤其對豬痢疾療效顯著。我國農業部168號公告規定,不超過35 kg仔豬可以使用喹乙醇藥物,用于促進其生長。動物喂食給藥的喹乙醇大部分以原形藥經尿液排泄到體外,此外其代謝產物還包括1-或4-單氮氧化物和3-甲基喹喔啉-2-羧酸(MQCA),其中MQCA被國際食品法典委員會認定為喹乙醇殘留標志物。我國農業部公告235號規定豬肉中MQCA的限量值為4 μg/kg,歐盟和美國則禁止在動物養殖中使用喹乙醇。2018年我國農業部發布2638號公告,要求停止生產喹乙醇原料藥及各種制劑;2019年5月1日起,喹乙醇被納入動物養殖禁止使用的藥物范圍。

目前,動物源食品中MQCA殘留量的前處理方式有酸解[1,2]和蛋白酶水解[3],其中酶解操作步驟繁瑣,檢測用時較長,而酸解處理的方式也更為便捷,且有文獻報道[1,4]可以通過提高酸解溫度縮短水解時間。動物源食品中MQCA殘留量的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法[5,6]、氣相色譜-質譜法[7]、高效液相色譜法[1,8]和液相色譜-串聯質譜法[9-14]。液相色譜-串聯質譜法具有高選擇性和高靈敏度的特點,適合食品中禁用藥物殘留量的測定。MQCA的相對分子質量較小,質譜檢測易受干擾而影響定性判斷,而通過更多的特征碎片離子信息匹配度的比較,可以提高方法的抗干擾能力。本文建立了液相色譜-串聯質譜檢測豬肉中MQCA殘留量的方法,采用觸發式多反應監測模式實現同時定量和確證,可為準確監控豬肉中MQCA的殘留狀況提供更可靠的檢測技術。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1260-6470型液相色譜-串聯質譜儀(配ESI源)、VAC ELUT-20固相萃取裝置(美國Agilent公司); Vortex-Genie2渦旋混勻器(美國Scientific Industries公司); SHA-B恒溫水浴振蕩器(常州智博瑞儀器制造有限公司)。

MQCA(純度99.0%,德國Dr. Ehrenstorfer公司);鹽酸、氯化鈉(上海國藥集團);氫氧化鈉(分析純,天津市大茂化學試劑廠);氨水(質譜純,上海安譜公司);乙酸乙酯、甲醇、乙腈(色譜純,美國Honeywell公司);甲酸(色譜純,美國Sigma公司)。強陰離子固相萃取小柱(MAX, 150 mg/6 mL,美國Waters公司);水為Milli-Q超純水。

確證測試樣品:豬肉樣品由中國檢驗檢疫科學研究院提供(編號17-D707), MQCA殘留量為3.52 μg/kg。

1.2 樣品前處理

稱取勻漿后的豬肉試樣2.0 g,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液,于50 ℃水浴振蕩提取30 min,依次加入5 mL乙腈、15 mL乙酸乙酯、2.5 g氯化鈉,渦旋混合1 min,以8 000 r/min離心5 min,上層有機相全部轉移至另一50 mL聚丙烯離心管中;加入5 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液,渦旋混合30 s,以8 000 r/min離心5 min。吸取下層全部水相層轉入經5 mL甲醇、5 mL水活化的MAX小柱內,再分別用5 mL水、5 mL甲醇、5 mL乙酸乙酯淋洗,用空氣吹干小柱內液體。用8 mL甲酸-乙酸乙酯(2∶98, v/v)溶液洗脫,收集全部洗脫液,于45 ℃下氮氣吹干,用1 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈(5∶95, v/v)溶液溶解殘渣,過0.22 μm尼龍濾膜,供LC-MS/MS測定。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取10 mg MQCA標準品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,配制1.0 g/L標準儲備液,于-18 ℃下保存;用甲醇稀釋標準儲備液,制得MQCA標準中間液,臨用現配。

基質匹配添加標準工作溶液:稱取6份陰性豬肉試樣,分別加入MQCA標準中間液,按1.2節處理,獲得質量濃度為1、2、5、10、20、50 μg/L系列標準工作溶液。

1.4 分析條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流動相A：乙腈；流動相B：0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫條件:0～1.00 min, 5%A; 1.00～2.00 min, 5%A～40%A; 2.00～3.00 min, 40%A～90%A; 3.00～4.00 min, 90%A; 4.00～4.01 min, 90%A～5%A; 4.01～7.00 min, 5%A。進樣體積:5 μL。

離子源:ESI源,正離子模式;掃描模式:動態多反應監測(dynamic MRM);毛細管電壓:3 500 V;霧化氣壓力:310.2 kPa;鞘氣溫度:325 ℃;鞘氣流量:12 mL/min;噴嘴電壓:500 V;干燥氣溫度:200 ℃;干燥氣流量:11 mL/min;碎裂電壓:135 V。觸發掃描閾值:100 cps;觸發進入時間:2 ms;觸發延遲時間:2 ms。MQCA的特征離子對和碰撞能量見表1。

表 1 MQCA的質譜參數

* Quantitative ion.

圖 1 不同碰撞能量下MQCA的二級質譜圖Fig. 1 MS/MS spectra of MQCA under different CEs

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

MQCA結構中有喹啉雜環,離子化時得到質子,形成[M+H]+母離子。在15、20和25 eV碰撞能量下分別碎裂母離子,獲得不同碰撞能量下的二級子離子全掃描質譜圖(見圖1)。碰撞能量為15 eV時,得到m/z為145.1、143.2、117.8、91.9、76.9的碎片離子,此碰撞能量下仍可見m/z為189.0的母離子,但相對豐度很低。碰撞能量提高至20 eV時,m/z為145.1和143.2的碎片離子強度有所下降,子離子全掃質譜圖中增加了m/z為127.9、102.1、65.0的特征峰,母離子的響應強度則與背景噪音水平相當。碰撞能量提高至25 eV時,沒有新碎片離子增加,所有碎片離子的響應強度基本和碰撞能量20 eV下相當,由此確定MQCA的二級碎片離子的m/z為145.0、143.0、128.1、117.9、102.3、91.8、77.0和65.2。進一步優化各碎片離子的最佳碰撞能量,m/z為145.0和143.0兩個特征離子的響應豐度最高,可作為多反應監測掃描離子,其中m/z為145.0的特征離子作為觸發掃描離子。

2.2 色譜條件的優化

MQCA具有酸堿兩性的特點,其在酸性環境條件下,表現出疏水性,反相色譜柱適合其分離。Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm)的固定相粒徑小,具有良好的保留性能,同時能縮短分析時間,適合酸性、堿性和中性化合物的分離。本文通過優化梯度洗脫條件,獲得了MQCA尖銳、對稱的色譜峰形和良好的色譜保留(見圖2)。本文用獲得的陰性豬肉基質提取測試液,配制基質標準溶液,對比了定容液配制的試劑標準溶液的分離效果(見圖3)。結果表明,MQCA能夠與基質背景中的大部分極性和弱極性干擾物分離,可以降低干擾物共流出對MQCA電離的影響。

圖 2 MQCA標準溶液(5 μg/L)觸發式多反應監測色譜圖Fig. 2 Trigger MRM chromatograms of MQCA standard solution (5 μg/L)

圖 3 陰性豬肉樣品、基質標準溶液和試劑標準溶液(5 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 3 TIC chromatograms of blank pork sample,matrix standard solution and reagent standard solution (5 μg/L)

2.3 樣品前處理條件的優化

動物組織樣品中MQCA殘留量的檢測多采用酶解[3,4]或酸水解[1,15]的前處理方式。酶解成本高,用時長,操作也繁雜;采用酸水解的方式,可以通過提高水解的溫度,進而縮短水解時間。本文比較了2.0 mol/L和0.3 mol/L鹽酸的水解效果,實驗發現,采用0.3 mol/L鹽酸水解提取后,提取液仍是酸性環境,這適合有機溶劑直接萃取目標物,而且提取效果也與采用2.0 mol/L鹽酸時一致,因此確定水解提取的鹽酸濃度為0.3 mol/L。

實驗比較了不同萃取試劑的萃取效果,分別采用正己烷、乙酸乙酯、乙腈-乙酸乙酯(1∶3, v/v)3種溶劑。采用正己烷萃取,萃取效率最低,且樣液乳化嚴重,高速離心后仍有一定乳化現象;采用乙酸乙酯萃取,乳化情況稍好;采用乙腈和乙酸乙酯混合體系萃取時,萃取效率最高,且試樣液中加入乙腈,可以沉淀試樣液中的蛋白質,再加入乙酸萃取,能明顯改善樣液的乳化現象。

MQCA在堿性條件可用陰離子交換固相萃取柱凈化[16]。萃取液中加入氫氧化鈉溶液,MQCA呈陰離子態,可被MAX小柱吸附。實驗依次用水、甲醇、乙酸乙酯淋洗小柱,以除去極性和非極性雜質,最后用酸化乙酸乙酯洗脫目標物。本文對洗脫溶液體積進行了優化,將含5.0、10.0和50.0 μg/kg 3個水平的上樣液分別加入小柱,經淋洗后,用酸化乙酯乙酯分多次洗脫小柱,每次用2 mL洗脫液,分別測試每次洗脫液中MQCA的含量,發現第4次洗脫小柱后,只有50.0 μg/kg水平試驗的洗脫液中有少量目標物檢出。當洗脫液增加到10 mL時,3個水平下的收集液中均未檢出目標物。因此最終本文確定洗脫體積為8 mL。

2.4 定量測定

用陰性豬肉樣品進行加標實驗,以目標物信噪比(S/N)的3倍和10倍水平分別確定檢出限和定量限,分別為0.15 μg/kg和0.5 μg/kg。

用陰性豬肉樣品按前述方法制備獲得的空白基質溶液,對比相同濃度的基質標準溶液與試劑標準溶液的響應值,發現樣品凈化后有基質增強效應,因此本文確定用基質匹配添加標準曲線定量。在1.0～50 μg/L范圍內,MQCA呈線性相關,相關系數(R2)為0.999 7。在0.5、1.0、5.0 μg/kg3個水平下進行加標回收試驗,MQCA的回收率為90.5%～119.6%,相對標準偏差為3.14%～4.22%(見表2)。

表 2 豬肉中MQCA的加標回收率(n=6)

圖 4 MQCA確證測試樣品質譜圖與參考標準品質譜圖對比Fig. 4 Comparison of mass spectra of the MQCA confirmed test sample with reference standard sample

2.5 確證實驗

定性離子豐度比或特征離子匹配度是質譜確證的主要方式,多反應監測的選擇性很高,但仍存在基質干擾導致假陽性的風險,尤其是小分子化合物的檢測。為提高確證結果的可靠性,選擇數量更多特征碎片離子的定性判斷會更可靠,但若連續監測全部離子對,會降低質譜循環掃描時間,影響定量結果數據點的獲取。觸發式多反應監測不僅能滿足定量分析的要求,而且可以通過觸發的二次掃描,獲得化合物確證的質譜譜庫[17],通過比對樣品譜圖與標準品譜圖,實現確證樣品中的待測物。實驗采用中國檢驗檢疫科學研究院提供的豬肉樣品進行確證實驗,測得樣品中MQCA含量為3.46 μg/kg,同時也獲得觸發式MRM的質譜圖。將該圖與標準品譜圖比對(見圖4),表明測試樣品所獲特征離子與標準譜圖全部匹配。通過陽性樣品的驗證測試,表明本方法可實現準確定量和確證。

3 結論

本文建立了液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中MQCA殘留量的方法,方法采用觸發式多反應監測模式,準確定量的同時也能獲取更多的質譜信息,對于基體復雜的樣品能實現可靠的定性確證。方法采用基質匹配添加標準曲線定量,方法回收率高,檢出限低,適合豬肉中MQCA殘留量的快速測定和確證。