固化pH梯度毛細管等電聚焦整體柱的制備及在蛋白質等電點分析中的應用

劉讓東, 許歆瑤, 王薇薇, 王 彥, 閆 超

(上海交通大學藥學院, 上海 200240)

美國Likky公司在1982年首次將重組胰島素投放市場,標志著第一個重組蛋白質藥物的誕生[1]。自其誕生以后,相對于傳統化學藥物而言,蛋白質藥物研發成本相對較低、風險較小且更安全可靠;因此,蛋白質藥物的研究成為現今藥物研發領域的熱點[2-7]。但是,蛋白質藥物的結構異常復雜,微小的結構改變常會對其生物活性和特異性表達有著明顯的影響。在蛋白質藥物的生產過程中,會因生產條件的變化而導致其異構體、突變物、多聚體等的形成。然而,用普通的檢測儀器(如HPLC、MS等)難以辨別這些細微差別所引起的等電點(pI)的變化,不能很好地對蛋白質藥物進行質量控制。

毛細管等電聚焦(capillary isoelectric focusing, cIEF)兼具傳統凝膠IEF(isoelectric focusing)的高分辨率和毛細管電泳的自動化、高效的優勢,可用于蛋白質純化的檢測、蛋白質等電點和電荷差異性測定等,在蛋白質分析和蛋白質組學等生命科學領域都有很好的應用。近年來,一些公司及科研機構陸續發表了cIEF方法用于單抗等生物兩性物質的研究工作。2018年,百時美施貴寶公司的Dai等[8]報道了采用cIEF-MS技術對單抗藥物的電荷異質性進行分離和表征。同年,Wang等[9]實現了利用cIEF-MS技術對肽類、蛋白質類以及單抗藥物的等電點和分子量的分析。Srivorakun等[10]基于cIEF系統來診斷東南亞人群中常見的血紅蛋白病;Meng等[11]通過對標準多肽的等電點的測定,驗證了cIEF-WCID(whole column imaging detection)的準確性和重復性。但是,這些自由溶液cIEF的方法需向樣品溶液中添加一定濃度的載體兩性電解質(carrier ampholytes, CAs),以保證形成pH梯度,這會導致其檢測波長可選性有限(一般選擇280 nm),且CAs還會帶來檢測穩定性差、靈敏度低、不易與MS聯用等缺點。

然而,固化pH梯度毛細管等電聚焦不需在緩沖溶液和樣品中添加其他的能產生pH梯度的物質,具有方法穩定、重復性好、檢測干擾小、靈敏度高的特點。同時,在固化pH梯度柱的制備過程中,基質材料的引入有可能拓寬原有CAs的pH范圍,從而達到對極端的酸性或堿性蛋白質檢測的目的。目前,聚合物材料因其制備簡單、操作方便而被廣泛地用作固化pH梯度毛細管等電聚焦柱的制備基質[12-19]。本文根據課題組[20]先前制備固化pH梯度涂層毛細管開管柱的方法,制備了pH 3～10范圍的基于聚乙二醇雙丙烯酸酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯材料(PEGDA-GMA)的固化pH梯度毛細管等電聚焦整體柱(M-IPG)。在柱上“單點”檢測時,制備的M-IPG柱的pH范圍能夠實現對所用CAs范圍的覆蓋。同時,基于該M-IPG柱具有較大反壓的特點,搭建了新型的等電聚焦平臺。為了檢驗該M-IPG柱的效果,設計了平行對照實驗:以曲托珠單抗和依那西譜為分析對象,同時用羥丙基纖維素(HPC)涂層柱與M-IPG柱對該蛋白質藥物進行等電點測定。另外,本文也將從實驗的各個角度對上述兩種方法進行對比,如等電聚焦柱的制備難易、pI的測定結果、峰寬、分離度、分析時間等。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CE1000毛細管電泳儀、qCE-3010/HVP高壓電源、TriSep-2100微流控制器(美國通微); KQ5200DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司); LC-20AD HPLC泵(日本島津); Longerpump LSP01-2A微流注射泵(河北保定蘭格恒流泵有限公司);漩渦VORTEX-GENIE2混合器(美國Scientific Industries); DZF-1B真空干燥箱(上海博泰實驗設備有限公司); JD200-3電子天平(鄭州南北儀器有限公司); Molcell 1805V摩爾細胞型純水儀(重慶摩爾水處理設備有限公司)。

PEGDA(質量分數97%,平均相對分子質量為258)、GMA(質量分數98%)、3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯(γ-MAPS,質量分數97%)(美國ALDRICH),偶氮二異丁腈(AIBN, AR(analytical reagent))(上海第四試劑廠),甲醇(AR)、正癸醇(AR)、二氯甲烷(AR)、H3PO4(AR)、NaOH(AR)(中國醫藥基團), Pharmalyte 3-10(reagent grade)(瑞典GE), HPC(質量分數98%)(美國Sigma),細胞色素c(cytochrome c, reagent grade)、胰蛋白酶原(trypsinogen, reagent grade)、肌紅蛋白(myoglubin, reagent grade)(中國Sangon),碳酸酐酶(carbonic anhydrase, 1.5 U/mg)、牛血清白蛋白(BSA, biotech grade)(中國J&K),依那西譜(etanercept,質量分數97%)(德國Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG),曲托珠單抗(trastuzumab,質量分數97%)(瑞士Roche),聚亞酰胺涂層毛細管(75 μm i. d., 375 μm o. d.)(河北永年銳灃色譜器件有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品溶液的配置

5%(質量體積分數)HPC溶液:取0.05 g HPC于1.5 mL的EP管中,加入600 μL 60 ℃純凈水,室溫下攪拌至完全溶脹,形成膠體,然后再加入400 μL純凈水,混合均勻,即為5%(質量體積分數)的HPC溶液。

標準蛋白質樣品:分別配置5 g/L的標準蛋白質儲備液;待用時分別移取適量上述蛋白質儲備液于一個0.5 mL離心管中,依次移取純凈水、已經制備好的5%(質量體積分數)HPC溶液和載體兩性電解質(Pharmalyte 3-10)加入其中,振搖使其混合均勻,制得相應樣品溶液。

稱取少許不同蛋白質純品,將其溶入去離子水中,標為貯備液,放入2～8 ℃的冰箱中。根據實際情況配置不同濃度的混合標準蛋白質溶液,具體各混合標準蛋白質溶液濃度見后文各色譜圖。

圖 1 固化pH梯度毛細管等電聚焦整體柱(M-IPG)的制備Fig. 1 Preparation of capillary isoelectric focusing with monolithic immobilized pH gradient (M-IPG)γ-MAPS: 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate; CAs: carrier ampholytes.

1.2.2M-IPG柱的制備

新買的毛細管分別經過1.0 mmol/L氫氧化鈉處理30 min、去離子水處理10 min、0.1 mmol/L鹽酸處理30 min、去離子水處理10 min、純甲醇處理30 min, N2氣吹干,待用。M-IPG柱的制備如圖1所示,配置50%(體積分數)的γ-MAPS甲醇溶液,并將該溶液填入上步中預處理的干燥毛細管中,待填滿后,于60 ℃烘箱中放置12 h。取出毛細管后,用甲醇沖1 h, N2氣吹干,待用。接下來,稱取GMA(15.0 mg)、PEGDA(30.0 mg)、甲醇(27.0 mg)和正癸醇(40.5 mg),混勻;然后加入AIBN(1.0 mg),混勻,N2氣吹5 min。取修飾后的50 cm長毛細管,用記號筆在柱長的35 cm處標記,然后吸取該溶液至標記處,兩端用橡皮塞密封,并于60 ℃下反應12 h。待反應完成后,取出毛細管柱,并依次用甲醇沖2 h、水沖1 h。

配置7%(體積分數)CAs溶液,并將該溶液通過HPLC泵注入上述毛細管整體柱中(入口端到檢測窗口),待完成后進行電遷移。將有整體填料的毛細管一端放入盛有20 mmol/L NaOH的陰極溶液中,無整體材料的毛細管一端放入盛有20 mmol/L H3PO4的陽極溶液中,調整CE儀器中的參數(12 kV,T(電壓從0 kV至12 kV所需時間)=360 s),待電流穩定后,繼續加電5 min后斷電。將該毛細管柱兩端用橡皮密封,于70 ℃烘箱中放置20 h。然后,依次用去離子水沖1 h、甲醇沖1 h后,用N2氣吹干,待用。因此,所得到的固化pH梯度毛細管柱的pH順序為從毛細管入口端到檢測窗口逐漸減小,即靠近窗口端的pH小。當在該等電聚焦柱上進行樣品分離時,pI小的蛋白質樣品將先被檢測。

1.2.3HPC涂層毛細管柱的制備

根據文獻[21]方法,取內徑為75 μm的毛細管,分別經純水、1.0 mmol/L NaOH溶液、甲醇各處理30 min,然后用N2吹干;將50 cm長的該毛細管充滿5%(質量體積分數)HPC,于室溫下放置2 h;用N2將HPC吹出后,將毛細管置于60 ℃烘箱中,然后調整溫度到140 ℃,待溫度穩定到140 ℃時,保持25 min。之后將該毛細管取出,用氮氣吹10 min,并于室溫下保存待用。

1.2.4M-IPG柱法采用1.2.2節中自制的M-IPG柱(有效長度/總長:35 cm/50 cm,內徑75 μm)進行試驗,該柱在使用前用H2O沖洗10 min,實驗在圖2所示的平臺中完成。在全柱進樣過程(從入口端到檢測窗口)中,通過八通進樣閥將供試品溶液注入定量環中,打開HPLC泵,將供試品溶液緩緩推入M-IPG柱中,待基線發生明顯跳動時,切換八通進樣閥和三通閥。之后,將該毛細管柱的出口端放入陽極緩沖溶液(20 mmol/L H3PO4)中;選擇正模式(入口端與零極接觸,出口端與正極接觸),設置電壓為12 kV,聚焦時間分別為20 min(曲托珠單抗)和25 min(依那西譜),并打開微流注射泵,使其提供陰極緩沖溶液(20 mmol/L NaOH)。聚焦完成后,關閉高壓電源,再次切換八通進樣閥和三通閥,將聚焦的蛋白質區帶移向檢測窗口。

圖 2 在線毛細管等電聚焦平臺Fig. 2 Online capillary isoelectric focusing (cIEF) platform

1.2.5HPC涂層毛細管等電聚焦柱法

使用涂層熔融石英毛細管(有效長度/總長:35 cm/50 cm,內徑:75 μm);新制備的50 cm長的HPC涂層毛細管使用前在距離出口端15 cm處燒制窗口,并用0.1%(質量體積分數,下同)HPC的水溶液沖洗5 min。將出口端用特氟龍管與1.0 mL注射器相連,入口端放入1.5 mL的供試品EP管中,抽拉注射器,使供試品溶液填滿整根HPC涂層毛細管柱。然后,將該毛細管柱的出口端放入陰極緩沖溶液(20 mmol/L NaOH+0.1% HPC)中,將入口端放入陽極緩沖溶液(20 mmol/L H3PO4+0.1% HPC)中。聚焦時,聚焦電壓為18 kV,聚焦時間為15 min。樣品遷移時,使用微流泵緩緩將聚焦樣品區推向檢測窗口。每兩次進樣間和實驗結束后,用0.1% HPC水溶液沖洗5 min。

2 結果與討論

2.1 HPC涂層毛細管柱

2.1.1HPC涂層毛細管柱的系統適用性及其線性關系

為了考察新制備的HPC涂層毛細管柱的系統適用性及其線性,配制了pH 4.8～10.2范圍的4種模型蛋白質(細胞色素c、胰蛋白酶原、肌紅蛋白、牛血清白蛋白)的供試品溶液進行等電聚焦分離。結果如圖3所示,HPC涂層毛細管柱能夠對4種模型蛋白質進行聚焦分離,且各峰的峰形良好。同時對4種模型蛋白質的等電點與其遷移時間進行線性擬合,其線性相關系數為r=0.988 7(不理想)。在對該HPC涂層毛細管柱進行電泳實驗時(實驗條件:緩沖溶液為pH 9.76的10 mmol/L H3PO4;電壓為18 kV;λ=236 nm;樣品為0.2 mmol/L硫脲,Mt(遷移時間)=34.5 min(裸管時,Mt=7.7 min)),發現該柱存在微小的電滲流;因此,推測該HPC涂層柱上的微小電滲流導致了上述不理想的相關系數。

圖 3 4種模型蛋白在羥丙基纖維素(HPC)涂層毛細管柱中的等電聚焦圖Fig. 3 Electropherogram of the four protein standards in the capillary coated with HPC (hydroxypropyl cellulose) EL (effective length)/TL(total length)=35/50; i. d.=75 μm; focusing voltage: 18 kV; focusing time: 15 min; u (flow rate) of mobilizing: 200 nL/min; detection wavelength: λ=280 nm. Samples: 0.2 mmol/L cytochrome c+0.2 mmol/L trypsin inhibitor+0.2 mmol/L myoglobin+0.2 mmol/L BSA (bovine serum albumin)+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10. pI: isoelectric point.

2.1.2HPC涂層毛細管柱的重復性

在相同的條件下,HPC涂層毛細管柱連續進樣6針的等電聚焦結果中,各模型蛋白質的遷移時間的RSDs在0.8%～1.8%之間,表明該HPC涂層毛細管柱的重復性良好。

2.1.3HPC涂層毛細管柱對曲托珠單抗和依那西譜的等電聚焦分離

圖4是曲托珠單抗和依那西譜在HPC涂層毛細管柱上的等電聚焦分離圖。可以看出,曲托珠單抗聚焦成單一主峰,而依那西譜為多重峰的混合物,這種結果與文獻[22,23]報道的一致。

圖 4 曲托珠單抗和依那西譜在HPC涂層毛細管柱中的等電聚焦分離圖Fig. 4 Electropherogram of trastuzumab in the capillary coated with HPC Experimental conditions are the same as those in Fig. 3. Samples: 0.1 mmol/L trastuzumab+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10, and 0.22 mmol/L etanercept+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10.

2.1.4HPC涂層毛細管柱對曲托珠單抗和依那西譜pI的測定

圖 5 (a)曲托珠單抗和(b)依那西譜的pI測定的等電聚焦圖Fig. 5 Electropherogram of pI determination of (a) trastuzumab and (b) etanercept in the capillary coated with HPC Experimental conditions are the same as those in Fig. 3. Samples: a. 0.1 mmol/L trastuzumab+0.2 mmol/L cytochrome c (labeled as inner mark 1)+0.2 mmol/L myoglobin (labeled as inner mark 2)+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10; b. 0.88 mmol/L etanercept+0.2 mmol/L myoglobin (labeled as inner mark 1)+0.2 mmol/L BSA (labeled as inner mark 2)+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10.

由2.1.1節中HPC涂層毛細管柱的線性相關結果可知,如采用外標法將會對實際結果影響較大,不適用對未知蛋白質進行pI測定。因此,根據2.1.3節的實驗結果并結合相關文獻報道[24],在2.1.1節供試品溶液的基礎上分別加入已知pI的內標物(細胞色素c、肌紅蛋白、牛血清白蛋白,具體見圖5)。在相同的實驗條件下,加內標蛋白質后的曲托珠單抗和依那西譜的等電聚焦結果如圖5a和5b所示。通過對內標蛋白質的等電點與其遷移時間進行線性相關性考察,可得到相應的線性方程,并將曲托珠單抗的遷移時間代入該方程可得到其等電點為8.1,該結果與文獻報道(pI=7.76～8.49)一致[25];同理,可得到依那西譜各峰的pI范圍為5.3～6.7,其與文獻報道(pI=4.5～6.8)一致[23]。

圖 6 (a)處理的毛細管柱、(b)GMA-PEGDA整體柱和(c)M-IPG的掃描電鏡圖Fig. 6 Scanning electron micrographs of (a) a modified capillary, (b) GMA-PEGDA (glycidyl methacrylate-poly(ethyleneglycol) diacrylate) monolith, and (c) M-IPG

2.2 M-IPG柱

2.2.1M-IPG柱的表征

圖6是預處理毛細管柱、GMA-PEGDA整體柱和M-IPG的電鏡圖。從圖6a可知,修飾后的毛細管柱內表面有一層薄薄的化合物,該薄層證明γ-MAPS被成功地鍵合到了毛細管的內壁上。在GMA-PEGDA整體柱中(圖6b),球形單元聚集成大簇并且能看到明顯的整體柱的穿透孔隙。通過與圖6b相比,圖6c的球形單元有微小的變化,說明這些球形單元的表面鍵合上了CAs分子。

圖 7 (a)GMA-PEGDA型整體柱及(b)M-IPG柱的紅外光譜Fig. 7 Infrared spectrum of (a) the GMA-PEGDA monolith and (b) M-IPG column

此外,從GMA-PEGDA型整體柱及M-IPG柱的紅外光譜(見圖7)可以觀察到3 433 cm-1處聚合物νO-H和νN-H的吸收峰,以及1 735 cm-1處νC=O的吸收峰。圖7b與圖7a相比,紅外區域存在3個明顯的差異區。由于圖7b的M-IPG柱中有CAs的存在,νN-H(3 433 cm-1)和νC-N(1 631 cm-1)吸收譜帶得到增強;此外,δC-H(1 385 cm-1)的吸收譜帶也被發現有增強,這也進一步證明了CAs已經被固化在了該整體柱上。

圖 8 5種標準蛋白質在M-IPG柱中的分離圖Fig. 8 Electropherogram of the five protein standards in the M-IPG column EL/TL=35/50; i. d.=75 μm; focusing voltage: 12 kV; focusing time: 25 min; u of mobilizing: 300 nL/min; detection wavelength: λ=280 nm. Samples: 0.2 mmol/L cytochrome c+0.2 mmol/L trypsinogen+0.2 mmol/L myoglobin+0.2 mmol/L carbonic anhydrase+0.2 mmol/L BSA+0.1% (w/v) HPC+3% (v/v) Pharmalyte 3-10.

2.2.2M-IPG柱的pH范圍和線性關系

為了驗證自制的M-IPG柱的pH范圍,選擇pH 4.8～10.2范圍的5種模型蛋白質混合物(牛血清白蛋白、碳酸酐酶、肌紅蛋白、胰蛋白酶原和細胞色素c)對其進行pH范圍表征。該混合物的等電聚焦分離情況如圖8所示,自制的M-IPG柱能夠成功地對該蛋白質混合物進行聚焦分離。同時,根據這些蛋白質的pI值與其出峰時間進行線性擬合,其相關系數為0.985 1。

2.2.3M-IPG柱的重復性、耐受性及使用次數

用M-IPG柱連續對5種模型蛋白質混合物(牛血清白蛋白、碳酸酐酶、肌紅蛋白、胰蛋白酶原和細胞色素c)進樣6針,其等電聚焦的遷移時間的RSD少于7.6%。在12 kV的高壓電場中,M-IPG柱可以運行不少于50次。當超過該次數后,隨著聚焦次數的進一步增加,M-IPG柱的聚焦效果會逐漸變差。當更高電場被使用時,M-IPG柱的使用次數也會顯著減少。

2.2.4M-IPG柱對曲托珠單抗和依那西譜的等電聚焦分離

如圖9所示,自制的M-IPG柱能夠對曲托珠單抗和依那西譜進行聚焦分離。在峰形上,曲托珠單抗仍為單一主峰,而依那西譜為多重峰,這表明該M-IPG柱能夠對蛋白質藥物進行聚焦分離。

圖 9 曲托珠單抗和依那西譜在M-IPG柱中的分離圖Fig. 9 Electropherograms of trastuzumab and etanercept in the M-IPG column EL/TL=35/50; i. d.=75 μm; focusing voltage: 12 kV; focusing time: 20 min; u of mobilizing: 300 nL/min; detection wavelength: λ=280 nm. Samples: 0.3 mmol/L trastuzumab; 0.66 mmol/L etanercept.

2.2.5M-IPG柱對曲托珠單抗和依那西譜的pI的測定

圖10是M-IPG柱對含內標的曲托珠單抗和依那西譜的等電聚焦分離圖。根據兩個內標的相應等電點,可以分別測得曲托珠單抗(pI=8.1)和依那西譜(pI=4.9～6.8)的等電點,該結果與HPC涂層柱的測定結果基本一致。

2.2.6M-IPG柱的分辨率

分辨率是色譜柱的重要性能參數,決定著分離的好壞。從圖10b可知M-IPG柱的真實分辨度不超過0.1 pH。

圖 10 (a)曲托珠單抗和(b)依那西譜在M-IPG柱中pI測定的等電聚焦圖Fig. 10 pI determination of (a) trastuzumab and (b) etanercept in the M-IPG column EL/TL=35/50, i. d.=75 μm; focusing voltage: 12 kV; focusing time: 20 min (trastuzumab) and 25 min (etanerecept); mobilizing: u of mobilizing: 200 nL/min; detection wavelength: λ=280 nm. Samples: a. 0.3 mmol/L trastuzumab+0.2 mmol/L myoglobin (labeled as inner marker 1)+0.2 mmol/L cytochrome c (labeled as inner marker 2); b. 0.66 mmol/L etanercept+0.2 mmol/L BSA (labeled as inner marker 3)+0.2 mmol/L myoglobin (labeled as inner marker 4).

2.3 HPC涂層毛細管等電聚焦和M-IPG方法的比較

對平行試驗的HPC涂層毛細管等電聚焦法和M-IPG法兩種聚焦方法進行了對比。從實驗操作的過程來看,HPC涂層毛細管等電聚焦法更加簡單,主要表現在等電聚集毛細管柱的制備和聚焦實驗操作簡單,但是該方法的樣品制備過程復雜、消耗的樣品和載體兩性電解質溶液更多、基線易發生漂移。對等電點的測定結果、出峰寬度、分離度和分析總時間(聚焦時間+遷移時間)進行了對比,結果見表1。在pI的對比中,HPC涂層毛細管等電聚焦法測定的結果與M-IPG法測定的結果基本一致,符合相關文獻的結果。在峰寬的對比中,HPC涂層柱的峰寬略小,表明其分離能力相差不多。同時,在分離的對比中,二者皆可滿足對該兩種蛋白質類藥物等電點測定的要求。HPC涂層柱對依那西譜的分離更好,而M-IPG柱對曲托珠單抗的分離更好。另外,蛋白質藥物聚焦后的峰形表明,該M-IPG柱的靈敏度較HPC涂層柱的高,基線更穩定;在分析時間上,M-IPG柱對依那西譜的分析時間明顯較HPC涂層柱短。

表 1 HPC涂層毛細管法和M-IPG法的對比

* The separation degree is determined by the minimum separation degree between the sample and the internal standard; W1/2stands for peak width at half height. /: the item is not considered.

3 結論

本文嘗試用新制的M-IPG柱對蛋白質藥物的pI值進行測定。實驗結果表明,在單克隆抗體藥物和融合蛋白質藥物的聚焦分離及pI測定中,新制的M-IPG柱與傳統的HPC涂層柱表現一致。在單點檢測平臺中,聚焦后的樣品遷移能夠在無電場作用下完成。以上結果都表明了該柱在進一步構建多維分離平臺進行蛋白質組學研究方面的潛力。特別是與質譜聯用時,M-IPG柱與HPC涂層柱相比具有更多的優勢:一是在電極緩沖液和樣品溶液中不添加CAs,提高靈敏度,避免離子源的污染;二是純水可以作為樣品溶劑,不會使蛋白質變性,并允許分析物以其完整的形式被分離和檢測。基于這種耦合技術,可以提供目標蛋白質的pI和相對分子質量信息,這將極大地促進蛋白質組學分析和生物標志物的發現。