外泌體分離技術(shù)及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

高方園, 焦豐龍, 張養(yǎng)軍, 秦偉捷, 錢小紅

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所, 蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京蛋白質(zhì)組研究中心, 國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心-北京, 北京 102206)

外泌體(exosomes)是一類由細(xì)胞分泌到胞外的囊泡,最早由Pan[1]和Johnstone[2]在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名。隨著研究的深入,人們[3]發(fā)現(xiàn)包括血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、癌細(xì)胞、干細(xì)胞等在內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞都可以產(chǎn)生外泌體,所產(chǎn)生的外泌體不僅存在于細(xì)胞培養(yǎng)液中,也存在于血液、尿液、母乳、唾液、胸腔積液等體液中。與其他兩種胞外囊泡(微囊泡和凋亡小體)相比,外泌體在產(chǎn)生方式、尺寸、密度和內(nèi)容物等方面存在明顯差異。不同于微囊泡“出芽”的形成方式,外泌體主要通過(guò)胞吐過(guò)程釋放至細(xì)胞外:首先細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷形成早期核內(nèi)體(early endosomes),早期核內(nèi)體進(jìn)一步內(nèi)陷形成多泡體(multivesicular bodies, MVBs),其中一部分多泡體與溶酶體(lysosome)融合,進(jìn)而降解;另一部分與細(xì)胞膜融合,將其內(nèi)部所包含的囊泡釋放至胞外,即為外泌體[4]。

外泌體具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì),其直徑為30～200 nm,密度為1.13～1.19 g/mL,組成包括細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA、DNA等物質(zhì),在其表面連接有大量的糖鏈,如甘露糖、聚乳糖胺和α-2,6-唾液酸等[5]。外泌體中常見(jiàn)的磷脂包括鞘磷脂、膽固醇、磷脂酰膽堿、神經(jīng)酰胺、磷脂酰膽堿等。但是由于特殊的產(chǎn)生方式,外泌體所含的脂質(zhì)可能與來(lái)源細(xì)胞膜存在顯著差異。例如,與PC-3細(xì)胞相比,PC-3細(xì)胞外泌體中含有較高豐度的鞘糖脂、鞘磷脂、膽固醇和磷脂酰絲氨酸[6]。外泌體常見(jiàn)的表面蛋白質(zhì)包括四跨膜蛋白(如CD63、CD9、CD81)、黏附蛋白(如L1CAM、LAMP2)、整合素和糖蛋白(如纖連蛋白)等[7,8],而外泌體囊泡內(nèi)蛋白質(zhì)則與來(lái)源細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)密切相關(guān),包含例如熱休克蛋白(HSP70、HSP90)和細(xì)胞骨架蛋白(actin、tubulin、cofilin)等[9]。除此之外,外泌體中還攜帶有來(lái)源細(xì)胞的miRNAs、mRNAs、non-coding RNAs、circular RNAs和DNA等遺傳物質(zhì)。外泌體的完整囊泡結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)其內(nèi)部生物分子不受體液中各種酶的影響從而保持其完整性和生物活性。例如,外泌體中包含的mRNAs和miRNAs在進(jìn)入受體細(xì)胞后仍具有翻譯蛋白質(zhì)、促進(jìn)病毒感染等功能[10]。據(jù)估計(jì),單個(gè)外泌體含有約≤100拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)和≤10 000拷貝數(shù)的核苷酸[11]。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體中既包含與細(xì)胞形成、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的共有成分,也包含與來(lái)源細(xì)胞的生物功能相關(guān)的特異分子。如B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有大量的主要組織相容性復(fù)合體蛋白質(zhì)MHC class Ⅱ和MHC class Ⅰ,血小板和T細(xì)胞來(lái)源的外泌體則包含諸如血管性血友病因子、穿孔素和顆粒酶等特殊蛋白質(zhì)[12],而癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體表面可能含有腫瘤特異的蛋白質(zhì)分子[13]。這類特異分子在外泌體介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與生理病理過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

1 外泌體的研究策略

外泌體包含大量跨膜蛋白質(zhì)和胞內(nèi)蛋白質(zhì),雖然不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體的大部分蛋白質(zhì)組成相近,但是也有少量蛋白質(zhì)具有細(xì)胞特異性,能夠反映分泌細(xì)胞的類型和病理生理?xiàng)l件。因此通過(guò)對(duì)外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,可以獲得有關(guān)來(lái)源細(xì)胞生理狀態(tài)的重要信息[14]。基于蛋白質(zhì)組學(xué)的外泌體研究可概括為如下流程(見(jiàn)圖1)[15]: (1)外泌體提取及表征;(2)基于高分辨質(zhì)譜的外泌體蛋白質(zhì)組鑒定;(3)利用生物信息學(xué)對(duì)外泌體蛋白質(zhì)組進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)分析。對(duì)于外泌體而言,尋找最佳的分離與表征方法是目前急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

2 外泌體的提取方法

如何高效、高純度地富集外泌體是實(shí)現(xiàn)其組學(xué)分析和功能研究的關(guān)鍵。然而外泌體體積小,密度低,加之在粒徑與組成方面存在異質(zhì)性,即使同種細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體也有可能形態(tài)各異[16],給外泌體的提取帶來(lái)巨大困難。而不同的細(xì)胞來(lái)源的外泌體不僅大小和標(biāo)志蛋白質(zhì)表達(dá)量存在差異[17,18],其密度也有所不同。例如B細(xì)胞的外泌體密度約為1.13 g/mL[19],上皮細(xì)胞外泌體密度約為1.19 g/mL[20]。另外,實(shí)際樣本中不僅存在大量高豐度雜質(zhì)蛋白質(zhì)的干擾,還有與外泌體具有相似生物物理學(xué)參數(shù)(表面化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)、尺寸、表面電荷、吸光度等)的其他類型囊泡,或某些疾病相關(guān)的免疫復(fù)合物和蛋白質(zhì)復(fù)合物。以上因素均可能嚴(yán)重影響外泌體的有效提取,給后續(xù)的組學(xué)分析和功能研究造成不可忽視的影響。

如今已發(fā)展了多種基于外泌體尺寸、密度及免疫表型的提取方法,包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、體積排阻色譜、免疫親和法等。

圖 1 基于高通量質(zhì)譜的外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略[15]Fig. 1 Overview of the methodological approaches in high-throughput mass spectrometry-based proteomic analyses of exosomes[15]

圖 2 常用的外泌體分離方法Fig. 2 Working principle of commonly used methods to isolate exosomes

2.1 超速離心法

超速離心法根據(jù)外泌體的密度及尺寸進(jìn)行分離。該方法包括一系列離心過(guò)程:首先在300、2 000和10 000 g離心力作用下去除樣本中的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大囊泡,隨后在110 000 g條件下收集外泌體,最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗沉淀以去除可溶的干擾蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖2a)。在該方法中,外泌體的提取效率受離心力、樣本黏度、PBS清洗次數(shù)等因素的影響,高黏度樣本[21]、多次清洗[22]可能導(dǎo)致較低的外泌體回收率。超速離心法是目前外泌體分離的“金標(biāo)準(zhǔn)”,是目前使用最為廣泛的方法,其優(yōu)勢(shì)包括方法成熟、適用于大體積樣本。然而,該方法的缺點(diǎn)在于需要依賴昂貴的儀器,操作耗時(shí)費(fèi)力,所得的外泌體易受蛋白質(zhì)聚合體和脂蛋白的干擾。

密度梯度離心法屬于一種更為嚴(yán)格的超速離心法,能夠根據(jù)樣品密度進(jìn)一步純化囊泡,克服蛋白質(zhì)共沉淀造成的污染。常用的分離介質(zhì)包括碘克沙醇[23]和蔗糖[24]。以蔗糖為例,實(shí)際操作時(shí),需要預(yù)先制備不同濃度梯度的蔗糖/D2O溶液,隨后加入待分離物質(zhì);在超速離心力的作用下,外泌體將在等密度區(qū)域(1.13～1.19 g/mL)駐留,收集該組分即可得純化的外泌體(見(jiàn)圖2b)。密度梯度離心法相較于傳統(tǒng)差速離心法提得的外泌體更純,但是操作更為繁瑣,離心耗時(shí)也更長(zhǎng)。

2.2 體積排阻色譜

體積排阻色譜法以不同粒徑的聚合物凝膠填料作為分離介質(zhì),基于尺寸特征實(shí)現(xiàn)外泌體的分離。操作時(shí),將樣本加入純化柱后用PBS洗脫,小分子可進(jìn)入凝膠孔內(nèi)而大分子直接流出,因此小分子駐留時(shí)間更長(zhǎng)(見(jiàn)圖2c)。通過(guò)收集適當(dāng)時(shí)間的組分,即可得到純化的外泌體。目前已有多種商品化的外泌體純化柱,包括GE Healthcare的EVSecond純化柱和Izon的qEV系列試劑盒等。該方法的優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需使用離心機(jī),樣品以自然滴落的方式收集;所得的樣本純度高,可有效去除雜蛋白質(zhì)的干擾;方法重現(xiàn)性好[25]。但是純化柱對(duì)樣本的體積有嚴(yán)格限制,不適用于處理體積較大的樣品,而且洗脫液會(huì)稀釋樣本,導(dǎo)致最終產(chǎn)物濃度低[26]。

2.3 超濾法

超濾法是另一種常用的根據(jù)尺寸差異實(shí)現(xiàn)外泌體分離的方法,其原理與傳統(tǒng)的膜分離法相同。該方法通常選用相對(duì)分子截留量為100 kDa的超濾管,能夠在提取外泌體的同時(shí)濃縮樣本量,尤其適用于細(xì)胞培養(yǎng)液、尿液等大體積樣本[27](見(jiàn)圖2d)。相比于超速離心法,超濾法在低轉(zhuǎn)速下即可實(shí)現(xiàn)外泌體的分離,耗時(shí)短且不影響外泌體的生物活性。但是濾膜吸附的囊泡和蛋白質(zhì),不僅嚴(yán)重影響外泌體的提取效率,還可能堵塞濾孔,降低濾膜的壽命[28]。

2.4 親和法

親和提取法是目前特異性最好的一種外泌體提取方法,也是唯一一種能夠識(shí)別特定細(xì)胞來(lái)源的外泌體的方法。外泌體的親和提取主要通過(guò)抗體與外泌體膜蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用實(shí)現(xiàn)(見(jiàn)圖2e)。所使用的抗體為單抗或多抗,目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是外泌體表面普遍具有的CD63、CD9、CD81等跨膜蛋白質(zhì)、膜聯(lián)蛋白質(zhì)和上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)等[29,30],也可以是癌細(xì)胞外泌體表面獨(dú)有的標(biāo)志性蛋白質(zhì)。例如,表面修飾A33(結(jié)腸上皮細(xì)胞特異性蛋白質(zhì))抗體的免疫磁珠能用于結(jié)腸癌細(xì)胞系LIM1215培養(yǎng)液中的結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體的提取[31];單抗藥物赫賽汀(該類藥物屬于人源抗原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)單克隆抗體藥物,適用于HER2過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌)修飾的免疫磁珠不僅能夠提取HER2過(guò)度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)液中的癌細(xì)胞外泌體,而且能夠捕獲惡性腹水中含有HER2的外泌體[32];利用anti-CD9抗體和抗前列腺特異性膜蛋白抗原(anti-PSMA)修飾的免疫磁珠,可以實(shí)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液和前列腺癌患者血漿中前列腺癌細(xì)胞外泌體的特異性提取[33]。此外,也可以通過(guò)凝集素與外泌體表面糖蛋白之間的親和作用力實(shí)現(xiàn)外泌體的富集。這種方法常用于尿液,選擇性稍遜[34]。Nakai等[35]利用蛋白質(zhì)T淋巴細(xì)胞膜蛋白4 (Tim4)與外泌體表面磷脂酰絲氨酸之間的特異性親和作用力,建立了一種外泌體純化方法。由于Tim4和磷脂酰絲氨酸之間的結(jié)合依賴于Ca2+,因此通過(guò)添加鈣離子螯合劑EDTA即可釋放捕獲的囊泡,得到完整結(jié)構(gòu)的外泌體。然而,由于抗原抗體結(jié)合需要足夠的作用時(shí)間,親合法普遍存在操作耗時(shí),提取效率低的缺點(diǎn),不適用于大規(guī)模的分析。另外,外泌體生物活性易受洗脫液中極端pH和鹽濃度影響,不利于下游實(shí)驗(yàn)[28]。

2.5 基于聚合物的共沉淀法

聚合物沉淀法是商業(yè)化外泌體提取試劑盒通常采用的策略,其中聚乙二醇是目前最常用的沉淀試劑。一般認(rèn)為聚合物沉淀法的原理是聚合物通過(guò)“劫持”水分子,降低外泌體溶解度,進(jìn)而在低速離心條件下發(fā)生沉降[5](見(jiàn)圖2f)。該方法通過(guò)常規(guī)離心即可實(shí)現(xiàn)分離,操作簡(jiǎn)單,囊泡回收率高[36],然而提取的產(chǎn)物包含大量的脂蛋白和RNA復(fù)合物,純度極差,而且其中的聚合物難以去除,對(duì)下游分析產(chǎn)生不良影響[37]。

2.6 外泌體提取新方法

鑒于現(xiàn)有方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低、特異性不佳等不足,難以滿足科研需求,近年來(lái)科研工作者們發(fā)展了多種新型外泌體提取方法,以實(shí)現(xiàn)外泌體快速高效的富集。

圖 3 基于TiO2的外泌體富集原理示意圖Fig. 3 Mechanism of TiO2-based exosome isolation

其中一個(gè)重要的分支是以微流控為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)外泌體的分離?；谖⒘骺丶夹g(shù)的外泌體分離檢測(cè)可概括為幾個(gè)主要類別,包括基于尺寸、表面帶電、免疫親和或流體技術(shù)等實(shí)現(xiàn)外泌體分離,具有所需樣本小、分離速率快、純度高等優(yōu)點(diǎn)?；诔叽绲耐饷隗w分離裝置包括納米孔[38]、納米通道[39]、納米過(guò)濾器[40]和納米孔膜[41]等,使用此類裝置能夠有效避免雜蛋白質(zhì)和其他種類胞外囊泡的干擾,得到粒徑較為均一的外泌體。根據(jù)外泌體表面帶負(fù)電這一特性,研究人員設(shè)計(jì)了多種能夠通過(guò)靜電作用力捕獲外泌體的微流控裝置。Yasui等[42]將ZnO金屬絲固定于微流控基座,利用金屬絲表面正電性質(zhì)富集外泌體,而當(dāng)在金屬絲表面涂覆中性Al2O3后,該裝置捕獲外泌體的能力受到嚴(yán)重影響。Heller等[43,44]設(shè)計(jì)了一種交流電微芯片裝置,能夠利用靜電作用力從血液中快速分離外泌體,隨后利用免疫熒光技術(shù)原位檢測(cè)所捕獲的外泌體,對(duì)疾病的早期診斷有極大幫助。基于免疫親和的微流控芯片技術(shù)具有極高的特異性,能夠從血樣中得到高純度的外泌體[45]。通過(guò)在芯片表面固載腫瘤外泌體特異性蛋白質(zhì)的抗體(表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體(EGFRvⅢ)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血小板源性生長(zhǎng)因子受體(hPDGFR)、平足蛋白(Podoplanin)、內(nèi)皮細(xì)胞受體蛋白酪氨酸激酶A2(EphA2)和西妥昔單抗(Cetuximab)),甚至能夠從血液中捕獲并分析腫瘤特異性外泌體[46]。利用流體技術(shù)同樣能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的高效分離。例如Liu等[47]通過(guò)在介質(zhì)中添加少量生物兼容性聚合物控制作用于外泌體上的黏彈力,由此實(shí)現(xiàn)外泌體的分離。Wu等[48]建立了一種基于聲學(xué)流體(即聲學(xué)和微流體的整合)的分離方法,能夠以無(wú)標(biāo)記和無(wú)接觸的方式從全血中直接分離外泌體,血細(xì)胞去除率超過(guò)99.999%。基于微流控的外泌體分離技術(shù)在疾病診斷領(lǐng)域表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。

此外,利用外泌體膜的相關(guān)性質(zhì)也能實(shí)現(xiàn)外泌體的提取分離。例如利用外泌體膜表面帶負(fù)電這一特征,Heller課題組[43,44]借助靜電作用力將外泌體捕獲在帶正電的電極周圍。Wu等[49]建立了一種名稱為細(xì)胞外囊泡全面恢復(fù)和凈化(extracellular vesicles total recovery and purification, EVTRAP)的胞外囊泡富集方法,利用磁球表面的親水基團(tuán)和親脂基團(tuán)與外泌體膜表面脂質(zhì)分子之間獨(dú)特的親和力實(shí)現(xiàn)外泌體的富集。Wan等[50]建立了一種基于脂質(zhì)納米探針的外泌體富集方法,探針一端為脂質(zhì),能夠插入外泌體表面的磷脂雙分子層,另一端為生物素,能夠與磁球表面的鏈霉親和素特異性結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)血漿中外泌體的快速、高效提取。本實(shí)驗(yàn)室從外泌體表面磷脂分子的結(jié)構(gòu)出發(fā),建立了一種全新的、基于TiO2和磷脂分子的磷酸基團(tuán)之間特異性相互作用的外泌體提取方法(原理見(jiàn)圖3)[51]。該方法將外泌體的提取時(shí)間由傳統(tǒng)超離法的7～10 h縮短至5 min,同時(shí)模型外泌體的回收率可達(dá)93.4%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他傳統(tǒng)方法。理論研究表明TiO2與外泌體之間存在有化學(xué)鍵參與的特異性相互作用,因此TiO2微球能夠?qū)崿F(xiàn)混合樣品和復(fù)雜實(shí)際樣本(血清)中外泌體的特異性富集。通過(guò)對(duì)胰腺癌患者血清外泌體與健康人血清外泌體的蛋白質(zhì)組研究,發(fā)現(xiàn)65種異常表達(dá)的蛋白質(zhì)(P<0.01, Log FC>2; FC: fold change),其中59種在胰腺癌患者中表達(dá)上調(diào),與包括胰腺癌在內(nèi)的多種癌癥密切相關(guān),證明該方法在基于外泌體的腫瘤標(biāo)志物研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

3 外泌體的表征手段

為獲得外泌體的大小、濃度、形態(tài)及蛋白質(zhì)組成等信息,可以通過(guò)電鏡、動(dòng)態(tài)光散射、納米顆粒跟蹤分析儀、蛋白質(zhì)免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞儀等對(duì)外泌體進(jìn)行表征。

通過(guò)電鏡可獲得外泌體的形態(tài)信息,不同類型的顯微鏡由于操作環(huán)境不同,得到的外泌體形態(tài)存在差異。例如,在掃描電鏡、透射電鏡和原子力顯微鏡中,外泌體呈現(xiàn)囊泡獨(dú)有的茶托形[5],可能由于樣品在固定或染色過(guò)程中極度脫水,導(dǎo)致外泌體塌陷所致。與之相反,在冷凍電鏡中外泌體呈現(xiàn)圓形,由于不會(huì)脫水變性,所得的外泌體形態(tài)可能更加接近囊泡的真實(shí)狀態(tài)[52]。另外,由于透射電鏡和原子力顯微鏡具有較高分辨率,也能夠提供外泌體磷脂雙分子層厚度、粒徑分布等信息[53]。Knepper等[53]通過(guò)對(duì)透射電鏡得到的200個(gè)囊泡進(jìn)行粒徑分析,結(jié)果表明尿液中外泌體的粒徑分布約為35～40 nm,磷脂雙分子層厚度約為直徑的1/5～1/10。透射電鏡結(jié)合免疫金標(biāo)記法能夠得到外泌體表面特征分子的信息[54],有助于揭示外泌體的產(chǎn)生機(jī)制與來(lái)源。

動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS)和納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)都是利用光學(xué)手段獲得囊泡粒徑分布的方法。兩者的不同之處在于動(dòng)態(tài)光散射通過(guò)檢測(cè)散射光的強(qiáng)度計(jì)算得到顆粒粒徑,而納米顆粒跟蹤分析通過(guò)追蹤單個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡計(jì)算得到樣品濃度、粒徑分布等信息[5]。目前兩種方法都被廣泛應(yīng)用于外泌體顆粒數(shù)目和粒徑分布的測(cè)量,但兩種方法也各有不足。動(dòng)態(tài)光散射法中散射光強(qiáng)度依賴于顆粒質(zhì)量(體積),混合體系中大囊泡的存在(即使只有很少的量)將嚴(yán)重影響測(cè)量結(jié)果,因此動(dòng)態(tài)光散射法更適用于單分散體系。而且動(dòng)態(tài)光散射法所得的結(jié)果強(qiáng)烈依賴于所應(yīng)用的數(shù)學(xué)算法。而采用納米顆粒跟蹤分析儀對(duì)不同粒徑范圍的囊泡進(jìn)行檢測(cè)時(shí),為了得到準(zhǔn)確的濃度和粒徑信息,需要根據(jù)所要測(cè)量的顆粒粒徑范圍對(duì)儀器分別校準(zhǔn),操作繁瑣。受檢測(cè)靈敏度所限,納米顆粒跟蹤分析儀適用于粒徑范圍50 nm～1 μm的顆粒,粒徑小于50 nm的外泌體無(wú)法檢測(cè)[55]。除此之外,兩種方法都依賴光散射和粒子的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行分析,難以區(qū)分合成的納米材料、大蛋白質(zhì)聚合體和生物囊泡[56]。

利用蛋白質(zhì)免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)可以對(duì)外泌體標(biāo)志性蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。其中蛋白免疫印跡是外泌體的經(jīng)典表征手段之一,操作時(shí)往往需要細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照。常用的外泌體標(biāo)志性蛋白質(zhì)包括四跨膜蛋白質(zhì)CD63、CD81、CD9、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、水通道蛋白2(AQP2,尿液中)和凋亡誘導(dǎo)因子6相互作用蛋白(Alix)等[57],內(nèi)參蛋白質(zhì)可以是肌動(dòng)蛋白(β-Actin)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH),陰性對(duì)照蛋白可以是阻抑素(PHB,線粒體標(biāo)志蛋白)[58]或鈣聯(lián)結(jié)蛋白Calnexin[56]。在酶聯(lián)免疫吸附,析法中,外泌體裂解液通過(guò)固載有抗體的固相基質(zhì),隨后與檢測(cè)抗體共孵育。兩種方法均存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題,相比較而言,酶聯(lián)免疫吸附分析法比蛋白質(zhì)免疫印跡法更加快速,適用于高通量分析[5]。

流式細(xì)胞技術(shù)針對(duì)外泌體的表面抗原標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè),能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的高通量、多通道分析。但由于外泌體粒徑小、折射率低,采用常規(guī)的流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)往往需要將外泌體與beads連接以增大表面積、增強(qiáng)反射,操作耗時(shí)費(fèi)力[54]。Tian等[59]搭建了一種高靈敏度的流式細(xì)胞儀(HSFCM),將可檢測(cè)的外泌體粒徑降至40 nm,能夠在不連接beads的情況下實(shí)現(xiàn)每分鐘10 000個(gè)外泌體的檢測(cè),并能夠結(jié)合免疫熒光的方法進(jìn)行外泌體標(biāo)志蛋白質(zhì)的定量檢測(cè),目前該儀器已商品化。

總之,雖然目前幾種常用的表征方法尚有不足,但是多種方法結(jié)合能夠提高對(duì)外泌體的表征精度。隨著各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展,未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)外泌體的準(zhǔn)確、快速、可靠分析。

4 外泌體的生物學(xué)功能及其臨床應(yīng)用

4.1 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體最初被認(rèn)為是細(xì)胞排出代謝廢物的一種方式,能夠幫助缺乏高效降解能力或位于排泄系統(tǒng)的細(xì)胞排出不必要的蛋白質(zhì)和RNA。近年來(lái),隨著人們對(duì)外泌體的深入了解,外泌體的多種生物功能先后被發(fā)現(xiàn)。如今外泌體作為一種細(xì)胞間交流、傳遞大量的生物功能分子的重要方式日益受到重視。外泌體與受體細(xì)胞的信息交流可能通過(guò)以下4種途徑實(shí)現(xiàn)(見(jiàn)圖4)[8,60]: (1)外泌體表面膜蛋白質(zhì)被目的細(xì)胞表面的受體識(shí)別,從而激活靶細(xì)胞;(2)外泌體在蛋白酶作用下產(chǎn)生的表面膜蛋白質(zhì)碎片可作為目的細(xì)胞表面受體的配體;(3)外泌體脂膜可以與目的細(xì)胞膜融合,將蛋白質(zhì)和RNA等內(nèi)容物釋放進(jìn)去,此類膜融合可能改變靶細(xì)胞的一些膜特性,例如脂質(zhì)和膜蛋白質(zhì)的密度及種類[61]; (4)目的細(xì)胞通過(guò)胞吞的形式攝入外泌體。

圖 4 外泌體參與細(xì)胞間信息交流的4種途徑Fig. 4 Four possible mechanisms of intercellular communication by exosomes

經(jīng)由以上幾種途徑,外泌體將其攜帶的生物信息運(yùn)輸?shù)街苓叞屑?xì)胞或經(jīng)血液等體液運(yùn)輸而被遠(yuǎn)處組織細(xì)胞攝取,進(jìn)而影響目的細(xì)胞的基本功能和基因表達(dá)。幾乎所有的細(xì)胞都可以在自發(fā)或在一定刺激條件下產(chǎn)生外泌體,不同的細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體具有不同的功能,這些外泌體參與了一系列生理和病理過(guò)程,如癌癥發(fā)生與發(fā)展、抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)、組織愈合等。

4.1.1正常細(xì)胞來(lái)源的外泌體

2007年,Valadi等[10]發(fā)現(xiàn)鼠源肥大細(xì)胞外泌體中的RNA可以轉(zhuǎn)移至其他小鼠或人肥大細(xì)胞,并在受體細(xì)胞中翻譯產(chǎn)生新的小鼠蛋白質(zhì),表明外泌體在細(xì)胞間mRNA和miRNA的傳遞中發(fā)揮重要作用,由此引起了人們對(duì)外泌體功能的極大關(guān)注。來(lái)自血細(xì)胞(包括血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞)的外泌體具有參與凝血、提供促血管生成因子、誘導(dǎo)血管生成等生理功能;妊娠期外泌體能夠影響局部血管生成、調(diào)節(jié)分化、激活免疫、促進(jìn)胚胎發(fā)育;肝臟細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體有利于維護(hù)肝臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)[62]。由此可見(jiàn),正常細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體對(duì)維持機(jī)體的正常生命活動(dòng)起重要作用。而腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等特殊來(lái)源的外泌體由于具有獨(dú)特的生物學(xué)功能,更加受到廣泛關(guān)注。

4.1.2腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體

與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞外泌體的分泌量增多,內(nèi)容物也存在明顯差異[63]。由于囊泡結(jié)構(gòu)的保護(hù),腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體內(nèi)攜帶有大量腫瘤細(xì)胞來(lái)源的活性生物分子,其特點(diǎn)包括[64]: (1)提供具有穩(wěn)定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子;(2)保持蛋白質(zhì)的生物活性;(3)攜帶其中的生物分子經(jīng)體液運(yùn)輸至遠(yuǎn)端器官;(4)膜融合的作用方式使得腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠與靶細(xì)胞之間進(jìn)行更有效的信息交流。以上特征使腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體成為腫瘤細(xì)胞與外界信息交流的一種理想方式,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

外泌體介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移:體外研究和體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)表明惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可以在全身水平上被同一腫瘤或遠(yuǎn)端腫瘤中惡性程度較低的癌細(xì)胞攝入,其內(nèi)所包含的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的mRNAs進(jìn)入轉(zhuǎn)移性較低的細(xì)胞后,能夠增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力[65]。外泌體介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移可能與多種作用機(jī)制相關(guān)。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可以通過(guò)體液進(jìn)入特定器官,建立有利于癌細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境,包括促進(jìn)受體細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、引發(fā)炎癥、促進(jìn)血管生成,為癌細(xì)胞的擴(kuò)散形成有利條件。Lyden課題組[66-68]針對(duì)外泌體介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)行了一系列深入研究,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體所包含的miR-200家族能夠促進(jìn)骨髓細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[68]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞外泌體能夠引導(dǎo)癌癥轉(zhuǎn)移至特定器官,在膜表面特異性整合素的作用下,腫瘤細(xì)胞外泌體首先在特定的器官累積,引起受體器官產(chǎn)生炎癥、生成血管,形成有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境,使得腫瘤細(xì)胞更容易轉(zhuǎn)移至該器官[66,67]。Maji等[69]揭示了惡性腫瘤細(xì)胞外泌體中的Annexin Ⅱ蛋白能夠促進(jìn)血管生成,為腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利的微環(huán)境。

外泌體介導(dǎo)腫瘤耐藥性:腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體中某些miRNAs和non-coding RNAs (lncRNA)的變化在腫瘤化療抗藥性的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Qu等[70]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34/miR-449,促進(jìn)晚期腎細(xì)胞癌細(xì)胞中的跨膜受體酪氨酸激酶anexelekto (AXL)和tyrosine-protein kinase Met (c-MET)表達(dá),引發(fā)舒尼替尼耐藥。而外泌體能夠?qū)⑦@一lncRNA運(yùn)輸至舒尼替尼敏感的癌細(xì)胞,從而傳播舒尼替尼的抗性。外泌體中的miR21能夠抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡,并通過(guò)結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor 1, APAF1)使得卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)紫杉醇的抗藥性[71]?？拱┧幬锛魉麨I能夠引起胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中miRNA-155表達(dá)上調(diào),上調(diào)的miRNA-155能夠促進(jìn)外泌體分泌并以此為載體向其他胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞輸送miRNA-155,傳播對(duì)吉西他濱的抗藥性[72]。此外,多種外泌體來(lái)源的miRNAs可能與肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性相關(guān)[73]。

外泌體介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸/免疫抑制:多項(xiàng)研究表明腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠抑制免疫相關(guān)的信號(hào)通路、阻礙機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫響應(yīng)。Chen等[74]研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞、乳腺癌和肺癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生攜帶程序性死亡分子1的配體(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)的外泌體,此類外泌體在血液中循環(huán),通過(guò)表面PD-L1與T細(xì)胞結(jié)合,導(dǎo)致T細(xì)胞在到達(dá)腫瘤細(xì)胞之前即受到抑制,達(dá)到遠(yuǎn)程干擾免疫細(xì)胞活性的效果。Chalmin等[75]則提出了腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的另一種作用機(jī)制。他們的研究表明腫瘤來(lái)源的外泌體能夠抑制骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞(該細(xì)胞是樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)、巨噬細(xì)胞和(或)粒細(xì)胞的前體,具有抑制免疫細(xì)胞應(yīng)答的能力)對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)督。Wang等[76]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體與巨噬細(xì)胞共孵育后,其內(nèi)的miRNA-301a通過(guò)下調(diào)抑癌基因PTEN(phosphate and tension homo-logy deleted on chromsome ten),激活PI3Kγ(phosphoinositide 3-kinaseγ)信號(hào)分子,使巨噬細(xì)胞被“馴化”成為能參與抗炎反應(yīng)、血管生成以及促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的M2型巨噬細(xì)胞。該研究證實(shí)了外泌體中miR-301a在腫瘤免疫逃逸以及轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用。

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體除了具有上述參與腫瘤器官靶向轉(zhuǎn)移、促進(jìn)受體細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、引發(fā)炎癥、促進(jìn)血管生成、改善腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境、增強(qiáng)腫瘤耐藥性以及介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸等多種作用之外,還能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的耐受[77]、傳遞輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)[78](見(jiàn)圖5)。因此,對(duì)腫瘤細(xì)胞外泌體的分析和檢測(cè)對(duì)于腫瘤的早期診斷、預(yù)后分析和療效評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值。

圖 5 腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體在癌癥發(fā)展過(guò)程中的作用[4]Fig. 5 Roles of tumor-derived exosomes in tumor progression[4]

4.1.3免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體

在免疫系統(tǒng)中,淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等均可以產(chǎn)生外泌體。研究表明免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠顯著影響機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,包括調(diào)節(jié)抗原呈遞、免疫激活、免疫監(jiān)督等。不同免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體功能不同,以樹(shù)突狀細(xì)胞(該細(xì)胞具有免疫刺激能力,是目前能夠激活初始T細(xì)胞的唯一抗原遞呈細(xì)胞)來(lái)源的外泌體為例,其外泌體的免疫刺激作用取決于來(lái)源細(xì)胞的成熟狀態(tài)。成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞外泌體內(nèi)包含能夠直接激活T細(xì)胞的MHC class Ⅰ和MHC class Ⅱ,共刺激分子如CD40、CD8、CD86和熱激蛋白,這些分子使樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有抗原呈遞、調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的生物功能[79]。Zitvogel等[80]經(jīng)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中含有的腫瘤多肽能夠啟動(dòng)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,根除或抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng),這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤免疫治療提供了新的研究思路。另外,樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源的外泌體也能夠通過(guò)激活其他免疫細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng),從而抑制腫瘤[81]。

B細(xì)胞分泌的外泌體同樣包含MHC Ⅱ-多肽復(fù)合物,能夠激活人和小鼠抗原特異性T細(xì)胞,從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的功能[36]。細(xì)菌或病原體感染的巨噬細(xì)胞外泌體能夠刺激巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌炎性介質(zhì),在增強(qiáng)機(jī)體免疫監(jiān)督方面發(fā)揮重要作用[82]。肥大細(xì)胞來(lái)源的外泌體也能夠參與機(jī)體免疫響應(yīng),包括促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖,刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子以及引發(fā)樹(shù)突狀細(xì)胞表型和功能成熟[83]。CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體同樣具有免疫調(diào)節(jié)的作用[84]。

4.1.4干細(xì)胞來(lái)源的外泌體

由于外泌體能夠反映其來(lái)源細(xì)胞的特性,不同干細(xì)胞來(lái)源的外泌體表現(xiàn)的生物功能也不盡相同,其中最受人們關(guān)注的一類干細(xì)胞外泌體來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于骨髓、脂肪、臍血、牙髓、滑膜液等部位,是一種能夠自我更新的多功能干細(xì)胞。由于具有多向分化、促進(jìn)組織修復(fù)、抗炎、免疫抑制和保護(hù)神經(jīng)等功能,間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞治療領(lǐng)域有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。大量研究工作表明,間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)旁分泌的形式發(fā)揮其生理功能,而外泌體作為一種細(xì)胞間傳遞信息的介質(zhì),在間充質(zhì)干細(xì)胞的功能行使中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠修復(fù)組織損傷[85]、抑制腫瘤生長(zhǎng)[86]和調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)[87],具有治療心肌梗死、自身免疫疾病、阿爾茲海默癥等疾病的潛力。

另外,也有研究[88]顯示間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體會(huì)促進(jìn)某些腫瘤生長(zhǎng)。但是由于外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)方面的復(fù)雜性,加之干細(xì)胞具有多向分化的能力,干細(xì)胞來(lái)源外泌體的詳細(xì)功能有待進(jìn)一步挖掘,其作用機(jī)制也有待深入探究。

4.2 外泌體在疾病診斷中的應(yīng)用

外泌體作為疾病診斷的標(biāo)志物具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì):(1)與正常細(xì)胞相比,病變細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體在分泌量和內(nèi)容物方面存在明顯差異。病變的細(xì)胞和組織能夠產(chǎn)生更多外泌體[89],例如,癌癥患者血液中外泌體的含量更高[54]。外泌體包含來(lái)源細(xì)胞多種特異性生物分子(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸),這類特異分子有利于識(shí)別體液中外泌體的細(xì)胞來(lái)源。(2)由于特殊的生成方式,外泌體的組成不同于來(lái)源細(xì)胞。其內(nèi)包含的一些特異性蛋白質(zhì)能夠揭示外泌體的起源、結(jié)構(gòu)和運(yùn)輸方式,有利于深入了解外泌體的產(chǎn)生機(jī)制。另外,一些在細(xì)胞裂解液中難以檢測(cè)到的、具有重要生物意義的低豐度蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì),在外泌體中豐度較高[90]。(3)病變細(xì)胞分泌的外泌體通過(guò)胞吐的過(guò)程進(jìn)入血液、尿液等體液,囊泡狀結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)外泌體內(nèi)部生物分子不受體液中蛋白酶、磷酸酶、核酸酶等干擾,有利于保持其結(jié)構(gòu)完整和生物活性,通過(guò)對(duì)此類體液進(jìn)行分析可以實(shí)現(xiàn)疾病的無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)檢測(cè)。

血清和血漿為常規(guī)檢測(cè)樣本,具有微創(chuàng)取樣的優(yōu)點(diǎn),是診斷疾病的理想樣本。血液中外泌體能夠作為胰腺癌[54]、胃癌[91]、肺癌[92]和阿爾茲海默[93]等疾病的早期診斷和療效評(píng)價(jià)提供潛在標(biāo)志物。血液外泌體來(lái)源的疾病標(biāo)志物主要包括蛋白質(zhì)和miRNA兩類。Melo等[54]發(fā)現(xiàn)利用胰腺癌細(xì)胞外泌體表面的磷脂酰肌醇聚糖-1(GPC1)能夠?qū)崿F(xiàn)胰腺癌早期診斷,利用該方法對(duì)血清中包含GPC1的外泌體進(jìn)行檢測(cè),能夠高特異性(100%)、高靈敏度(100%)地區(qū)分胰腺癌患者(246例)和正常人(20例)以及慢性胰腺炎患者(37例)。Taylor等[94]的研究結(jié)果顯示卵巢癌患者與良性卵巢疾病患者血清外泌體中的miRNA表達(dá)譜有明顯差異,表明血清外泌體中的miRNA可以作為卵巢癌活檢的替代診斷標(biāo)志物。多項(xiàng)研究[95-97]表明外泌體中的miR-21在包括大多數(shù)癌癥的多種病理?xiàng)l件下過(guò)度表達(dá)。

尿液外泌體來(lái)源于泌尿系統(tǒng)相關(guān)的各種細(xì)胞,包括腎小球足細(xì)胞、腎小管細(xì)胞和膀胱等,因此尿液外泌體數(shù)目、形態(tài)和生化性質(zhì)的改變往往反映泌尿系統(tǒng)疾病。Widmark等[98]通過(guò)對(duì)前列腺癌癥患者尿液中的外泌體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,鑒定到兩種已知的前列腺癌癥標(biāo)志物PCA-3 (prostate cancer antigen 3,前列腺癌抗原3)和TMPRSS2: ERG (the fusion gene of transmembrane protease serines to ERG,跨膜蛋白酶絲氨酸與ERG的融合基因),表明尿液外泌體具有診斷和監(jiān)測(cè)癌癥患者狀態(tài)的潛力。除已知的疾病標(biāo)志物,Rodríguez等[99]通過(guò)對(duì)28例前列腺癌癥患者和19例正常人尿液外泌體中的miRNA進(jìn)行深度測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)兩種miRNA(miR-196a-5p和miR-501-3p)在前列腺癌患者組明顯下調(diào),表明尿液外泌體中的特異性miRNA可能作為前列腺癌的新型生物標(biāo)志物。Khurana等[100]將研究對(duì)象由miRNAs擴(kuò)大至多種類型RNA,通過(guò)對(duì)慢性腎病患者尿液外泌體中各類RNA進(jìn)行系統(tǒng)研究,在慢性腎病患者組中識(shí)別出30種顯著差異的lncRNAs,表明尿液外泌體中的lncRNAs具有作為慢性腎病早期診斷標(biāo)志物的潛力。Skotland等[101]的研究則表明尿液外泌體中的脂質(zhì)能夠作為前列腺癌的新型標(biāo)志物,3種脂質(zhì)標(biāo)志物結(jié)合使用能夠有效提高對(duì)前列腺癌的診斷靈敏度(93%)和特異性(100%)。

除血液和尿液外,其他體液中包含的病變細(xì)胞來(lái)源的外泌體也有可能成為疾病的重要標(biāo)志物。唾液中包含來(lái)自于唾液腺上皮體外細(xì)胞的外泌體,Michael等[102]從唾液中提取外泌體,并對(duì)唾液外泌體中的miRNA進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)此類miRNA有望作為成為唾液腺疾病的生物標(biāo)志物。Wu等[103]成功從汗液中提取得到外泌體,并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,在汗液外泌體中共鑒定到1 062種蛋白質(zhì),其中包含多種抗菌肽和免疫因子,表明汗液外泌體參與皮膚免疫。Liu等[104]從患有阿爾茲海默癥患小鼠的腦脊髓液中提取得到外泌體,并與野生型小鼠進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組miR-193b顯著下調(diào),該結(jié)果與血液外泌體結(jié)果一致。

由此可見(jiàn),外泌體來(lái)源的內(nèi)容物可作為多種疾病的潛在標(biāo)志物,為臨床診斷提供有用信息。通過(guò)對(duì)體液中外泌體進(jìn)行檢測(cè),更是能夠以無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的方式實(shí)現(xiàn)疾病診斷,具有良好的應(yīng)用前景。

4.3 外泌體在疾病治療中的應(yīng)用

4.3.1外泌體用于癌癥免疫治療

基于免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠介導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng),外泌體在腫瘤免疫治療方面的潛力受到廣泛關(guān)注。其中樹(shù)枝狀細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體包含大量的MHC-多肽復(fù)合物和免疫刺激相關(guān)的分子,能夠激活相關(guān)的T細(xì)胞,介導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答,在多個(gè)臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤療效[105]。Morse等[105]考察了樹(shù)枝狀細(xì)胞外泌體對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的療效。結(jié)果表明,患者對(duì)樹(shù)枝狀細(xì)胞外泌體耐受性良好,1/3患者表現(xiàn)出了對(duì)樹(shù)枝狀細(xì)胞外泌體的T細(xì)胞響應(yīng),2/4患者自然殺傷細(xì)胞活性得以激活。Escudier等[106]公布了利用自體樹(shù)突狀細(xì)胞外泌體免疫治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的臨床一期試驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)自體樹(shù)突狀細(xì)胞外泌體無(wú)明顯毒性,并且具有刺激自然殺傷細(xì)胞的能力。以上臨床試驗(yàn)證明了外泌體免疫療法的安全性和可行性,為進(jìn)一步臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

4.3.2外泌體作為藥物載體

由于特殊的結(jié)構(gòu)和循環(huán)方式,外泌體作為藥物運(yùn)輸?shù)妮d體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如外泌體的尺寸分布能夠增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng),從而有選擇性地深入腫瘤組織;其外層磷脂雙分子層可以保護(hù)內(nèi)容物不受各種生物酶的影響,維持各種生物分子的活性;外泌體普遍存在于各種體液和組織中,其體積小,結(jié)構(gòu)、組成與細(xì)胞膜類似,導(dǎo)致外泌體可以在避開(kāi)免疫系統(tǒng)監(jiān)督的同時(shí)深入組織內(nèi)部,有較好的生物相容性;當(dāng)采用內(nèi)源外泌體時(shí),能明顯降低其他藥物載體可能引起的有害免疫反應(yīng);除此之外,某些細(xì)胞來(lái)源或經(jīng)特殊修飾過(guò)的外泌體具有良好的特異性,可以與特定的器官或組織結(jié)合[107]。因此,載藥成為外泌體研究的一個(gè)重要分支,具有良好的應(yīng)用前景。

在外泌體中引入藥物的方式包括體內(nèi)裝載和體外裝載兩種。體內(nèi)藥物裝載可以通過(guò)傳統(tǒng)方法(如病毒轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔等)轉(zhuǎn)染來(lái)源細(xì)胞,編碼感興趣的RNA或蛋白質(zhì),也可以使藥物與來(lái)源細(xì)胞共混,使細(xì)胞分泌產(chǎn)生含有目標(biāo)生物分子的外泌體。體外藥物裝載則首先需要得到純化的外泌體,然后將感興趣的藥物通過(guò)電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法裝入純化的外泌體。外泌體內(nèi)可裝載的藥物包括小分子化學(xué)藥物[108,109]、蛋白質(zhì)和多肽[110]、核酸藥物[111]、天然產(chǎn)物[112]等。

Pascucci等[108]將包含有紫杉醇的間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體與胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)裝載紫杉醇的間充質(zhì)細(xì)胞外泌體具有很強(qiáng)的抗腫瘤增殖效果。Tian等[109]為降低免疫原性與毒性,采用小鼠未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞所產(chǎn)生外泌體作為藥物載體。同時(shí)為實(shí)現(xiàn)外泌體運(yùn)輸?shù)陌邢蛐?使細(xì)胞表達(dá)能夠識(shí)別乳腺癌細(xì)胞的外泌體膜蛋白Lamp2b (lysosomeassociated membrane glycoprotein 2b,溶酶體相關(guān)膜蛋白2)。并采用電穿孔的方法,在純化所得的小鼠未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞外泌體中載入阿霉素。結(jié)果表明該外泌體能夠特異性的將阿霉素傳遞給腫瘤組織,抑制腫瘤生長(zhǎng)且無(wú)明顯毒性。Haney等[110]將用于治療帕金森氏綜合征的過(guò)氧化氫酶包入外泌體,能夠明顯提高藥物載入的效率,維持藥物的持續(xù)釋放,具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明多種miRNA(例如miR-124)有助于修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷,然而由于核酸易于降解,加之大部分小分子難以通過(guò)血腦屏障,使得核酸藥物難以發(fā)揮作用。Yang等[111]利用外泌體能夠通過(guò)血腦屏障這一天然優(yōu)勢(shì),并進(jìn)一步將狂犬病病毒糖蛋白與外泌體溶酶體相關(guān)的膜蛋白融合,經(jīng)改造后的外泌體能夠靶向地將miR-124運(yùn)輸至腦梗部位,對(duì)修復(fù)缺血性損傷神經(jīng)有顯著效果。Zhuang等[112]通過(guò)自組裝的方法將姜黃素裝入外泌體中,用于增強(qiáng)藥物的抗炎性。外泌體不僅能夠增加疏水性天然藥物的溶解度、穩(wěn)定性和生物利用度,也能夠提高姜黃素的傳輸效率。由此可見(jiàn),外泌體作為一種新型的藥物載體具有廣泛的應(yīng)用前景。

如今,伴隨對(duì)外泌體分泌機(jī)制、功能的深入了解,人們意識(shí)到外泌體作為細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì),不僅參與生物體內(nèi)正常的生理功能,還涉及某些疾病的發(fā)病機(jī)理,包括腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等。外泌體被認(rèn)為是疾病的生物標(biāo)志物和預(yù)后因子,加之能夠作為基因和藥物遞送的載體,具有重要的臨床診斷和治療意義。

5 展望

外泌體作為細(xì)胞間信息交流的重要介質(zhì),既對(duì)維持機(jī)體的正常生命活動(dòng)起重要作用,也在腫瘤、免疫、組織修復(fù)等領(lǐng)域發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能,因而受到廣泛關(guān)注。隨著研究的不斷深入,外泌體的各項(xiàng)功能逐漸被挖掘,越來(lái)越多的分離提取技術(shù)不斷涌現(xiàn)。但目前依然存在著一些重大問(wèn)題與挑戰(zhàn),例如不同細(xì)胞來(lái)源外泌體在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制尚不明確;尚無(wú)一種方法能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)外泌體快速、高效、高純度、無(wú)損傷的提取,難以滿足目前科研和臨床的需求。雖然如此,隨著分離和檢測(cè)技術(shù)的不斷開(kāi)發(fā)、融合,外泌體在不同領(lǐng)域的諸多潛能終將會(huì)被發(fā)掘。