分散固相萃取結合氣相色譜-高分辨質譜快速篩查醬油中多種氯丙醇

黃超群, 陳欽可, 陳 麗, 王云宇, 馬 喆, 沈 咪, 黃佳波

(浙江省檢驗檢疫科學技術研究院, 浙江 杭州 310016)

隨著人們生活水平的提高,調味品的需求量大大增加,傳統的通過長時間微生物發酵、水解蛋白質生產得到的調味品已無法滿足需求,隨之產生了添加水解植物蛋白質的復合調味品,其中就包含配制醬油。水解植物蛋白質是植物性蛋白質在鹽酸催化及高溫條件下水解后的產物。其水解速度快,可極大縮短生產周期,降低成本;同時水解植物蛋白質中含有的氨基酸系列物質,能增加食品中的營養成分。但是,在酸水解過程中發生的副反應也會產生3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)等氯丙醇類物質[1,2]。這類物質具有致癌性,也會引起不育癥,其中以3-MCPD的毒性最大。因此,各個國家、組織對調味品中3-MCPD都著有嚴格的限量規定:我國[3]與國際食品法典委員會(CAC)[4]對于添加了酸水解植物蛋白質的液態調味品中3-MCPD規定的限量為0.4 mg/kg;歐盟[5]對于3-MCPD在水解植物蛋白質及醬油中的限量更為嚴格,均為0.02 mg/kg。

目前,食品中氯丙醇的檢測通常采用固相萃取凈化,用七氟丁酰咪唑等衍生試劑將氯丙醇衍生后,利用氣相色譜-質譜法[2,6-9]或氣相色譜-串聯質譜法[10]進行測定。在此類方法中,衍生步驟復雜,衍生物穩定性較差,給氯丙醇的準確測定帶來了一定難度。同時,衍生試劑昂貴,增加了檢測成本。因此,有研究人員嘗試采用非衍生化法測定氯丙醇的含量,且已有文獻報道采用固相萃取[11]或在線凝膠色譜[12]凈化后,用氣相色譜-串聯質譜非衍生化法測定氯丙醇的方法。

相較于固相萃取或凝膠色譜凈化方法,分散固相萃取是一種更為快速、簡便的前處理方法。分散固相萃取結合具有高質量精度、高通量等優勢的高分辨質譜技術,已在食品殘留分析檢測領域得到應用[13-16],而其應用于食品中氯丙醇含量的測定方法未見報道?；诖?本研究采用分散固相萃取進行前處理,應用氣相色譜-高分辨質譜技術,實現了醬油中4種氯丙醇含量的同時快速篩查檢測。本文建立的方法具有前處理易操作、定性定量準確等特點,滿足日常醬油中多種氯丙醇含量的檢測需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

PEGASUS GC-HRT氣相色譜-高分辨質譜儀,配電子轟擊源(美國Leco公司); AE260電子天平(瑞士Mettler公司); YP502N電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司); MS3 BASIC渦旋混合器(德國IKA公司); P300H超聲波清洗器(德國ELMA公司); N-1100旋轉蒸發儀(日本東京理化器械株式會社); MULTIFUGE X1R離心機、SORVALL LEGEND MICRO 17R離心機(美國Thermo公司)。

1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP,純度99.6%)、五氘代2,3-二氯-1-丙醇(D5-2,3-DCP,純度98.0%)、五氘代2-氯-1,3-丙二醇(D5-2-MCPD,純度98.0%)購自北京曼哈格生物科技有限公司;2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP,純度98.0%)、2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD,純度98.0%)購自加拿大TRC公司;3-MCPD(純度99.3%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;五氘代1,3-二氯-2-丙醇(D5-1,3-DCP,純度99.2%)、五氘代3-氯-1,2-丙二醇(D5-3-MCPD,純度97.5%)購自加拿大CDN公司;乙酸乙酯(色譜純)購自西班牙Scharlau公司;N-丙基乙二胺(PSA)購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1標準儲備液

準確稱取氯丙醇及氘代氯丙醇標準物質各10 mg,用乙酸乙酯溶解,分別轉移至8個50 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,搖勻,配制成濃度為200 mg/L的標準儲備液。

1.2.2標準中間液

準確移取25 μL 1,3-DCP、50 μL 2,3-DCP、250 μL 2-MCPD和500 μL 3-MCPD標準儲備液至同一10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制成3-MCPD質量濃度為10 mg/L的氯丙醇混合標準中間液;準確移取25 μL D5-1,3-DCP、50 μL D5-2,3-DCP、250 μL D5-2-MCPD和500 μL D5-3-MCPD標準儲備液至同一10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制成D5-3-MCPD質量濃度為10 mg/L的氘代氯丙醇混合標準中間液。

1.2.3標準工作液

準確移取氯丙醇混合標準中間液20、50、100、200和500 μL于10 mL容量瓶中,分別加入100 μL氘代氯丙醇混合標準中間液,用乙酸乙酯定容,配制成3-MCPD質量濃度分別為20、50、100、200和500 μg/L的標準工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

稱取2 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中,加入10 μL氘代氯丙醇混合標準中間液和20 mL乙酸乙酯,渦旋0.5 min,超聲10 min,以4 000 r/min的速度離心3 min,移取上層溶液至150 mL濃縮瓶。下層殘余物用20 mL乙酸乙酯重復提取一次,合并乙酸乙酯層至同一濃縮瓶中,于40 ℃濃縮至近干,用乙酸乙酯定容至1 mL,待凈化。

1.3.2凈化

將上述溶液轉移至裝有150 mg PSA的1.5 mL離心管中,渦旋1 min,以10 000 r/min的速度離心3 min。取上清液,過膜后供氣相色譜-高分辨質譜儀檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫:初始100 ℃,保持2.0 min,以15 ℃/min的速率升溫至220 ℃,保持5 min;進樣口溫度:230 ℃;傳輸線溫度:250 ℃;載氣:氦氣,純度≥99.999%,流量為1.5 mL/min;進樣量:2.0 μL;進樣方式:不分流進樣。

圖 2 醬油樣品中3-MCPD的選擇離子色譜圖Fig. 2 SIM chromatograms of 3-MCPD in soy sauce sample a. m/z 43.0182; b. m/z 44.0258; c. m/z 61.0285; d. m/z 78.9944; e. m/z 79.

1.4.2質譜條件

離子源:電子轟擊(EI)源;電離能量:70 eV;離子源溫度:200 ℃;分辨率:≥20 000;溶劑延遲:5.0 min; 4種氯丙醇及其同位素內標監測離子保留時間、質荷比信息見表1。

表 1 4種氯丙醇及其同位素內標監測參數

圖 1 3-MCPD的全掃描質譜圖Fig. 1 Full scan spectrum of 3-MCPD

2 結果與討論

2.1 監測離子質荷比的確定

按1.4節方法分別對4種10 mg/L氯丙醇及同位素內標進行高分辨質譜全掃描,獲得目標物的保留時間、碎片離子等信息,選擇一個靈敏度高、干擾少的碎片離子作為目標物的定性、定量離子。圖1為3-MCPD的全掃描高分辨質譜圖,對其各主要碎片離子在實際樣品中的靈敏度及其干擾情況進行考察,結果如圖2a～2d所示。質荷比為78.994 4的離子相較于其他離子具有更高的信噪比,而且受干擾也少。若采用普通低分辨質譜進行檢測,碎片離子m/z79受到較大干擾,無法準確定性和定量(見圖2e),因此選擇m/z78.994 4作為3-MCPD的高分辨質譜監測離子。同樣地,確定了其他3種氯丙醇的監測離子,詳見表1。

表 2 4種氯丙醇化合物的線性范圍、線性方程、相關系數和定量限

Y: peak area ratio of chloropropanols and their isotope internal standards;X: mass concentration of chloropropanols (μg/L).

2.2 提取溶劑的優化

4種氯丙醇類化合物溶于甲醇、乙腈、乙醚、乙酸乙酯等有機溶劑,實驗中選用乙腈、乙酸乙酯作為提取劑,通過加標回收試驗,比較了2種提取劑對氯丙醇類化合物的提取效果。結果表明,乙腈、乙酸乙酯對氯丙醇類化合物的提取效率均在90%以上,然而采用乙腈作為提取液時帶入了更多的雜質。圖3a和3b為采用2種提取劑處理后的醬油樣品的總離子圖,采用乙腈作為提取液,總離子圖上雜質峰明顯多于乙酸乙酯。因此,本研究采用乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.3 分散固相萃取條件的優化

醬油的成分復雜,包含多種氨基酸、糖類、有機酸、色素及香料等成分。而PSA作為一種凈化劑,常被用于分散固相萃取方法以除去樣品中糖類、有機酸和色素[17],因此本研究考察了PSA對于醬油的凈化效果,并對其用量進行優化。

為確定提取后樣液中存在的主要雜質,對大量未經凈化的樣液進行了篩查。結果表明,樣品總離子圖上主要存在兩個明顯的雜質峰(見圖3b)。對其質譜圖分析得出,兩種化合物分別為乙酰丙酸(Peak 1)和苯甲酸(Peak 2)。乙酰丙酸也是植物蛋白質酸水解發生的副反應產物[18],而苯甲酸是一種醬油中常用的防腐劑,GB 2760-2014規定醬油中苯甲酸限量為1.0 g/kg。PSA的加入,能有效祛除醬油提取液中這兩種化合物(見圖3c和3d)。對其用量優化表明,當PSA用量為150 mg時,所篩查醬油樣品中乙酰丙酸和苯甲酸能被完全祛除。因此,本研究確定的PSA用量為150 mg。

圖 3 不同處理條件下醬油樣品的總離子圖Fig. 3 Total ion chromatogram of soy sauce sample treated under different conditions a. Extracted by acetonitrile, without clean-up; b. extracted by ethyl acetate, without clean-up; c. extracted by ethyl acetate, treated with 50 mg N-propylethylenediamine (PSA); d. extracted by ethyl acetate, treated with 150 mg PSA. Peak 1. levulinic acid; peak 2. benzoic acid.

2.4 方法學考察

2.4.1線性范圍和定量限

在確定的色譜和質譜條件下,對標準工作液進行測定,以氯丙醇化合物質量濃度(X, μg/L)為橫坐標、氯丙醇化合物與其同位素內標峰面積之比(Y)為縱坐標繪制標準曲線。結果表明,4種氯丙醇化合物線性關系良好,相關系數均大于0.999,其線性范圍、線性方程及相關系數詳見表2。同時,根據樣液中4種氯丙醇化合物的響應情況,確定了醬油中4種氯丙醇化合物各自的定量限(S/N≥10),滿足國內外對于3-MCPD的限量要求。

2.4.2回收率和精密度

在空白醬油樣品中分別添加3個濃度水平的4種氯丙醇化合物,每個濃度水平重復測定6次,計算回收率及其相對標準偏差。如表3所示,醬油中4種氯丙醇化合物的回收率范圍為78%～103%,相對標準偏差均不大于8.8%。本方法能夠滿足醬油中4種氯丙醇快速篩查檢測的要求。

表 3 醬油中4種氯丙醇的加標回收率和精密度(n=6)

2.5 實際樣品檢測

采用本方法與標準方法GB 5009.191-2016(第二法)對3-MCPD檢出的樣品進行測定,兩種方法的檢測結果基本一致(見表4)。相較于GB 5009.191-2016,本方法無需固相萃取凈化及衍生化反應,更為簡便快速,試劑耗材成本更低。

表 4 采用不同方法的3-MCPD測定結果

3 結論

本研究建立了一種分散固相萃取結合氣相色譜-高分辨質譜測定醬油中4種氯丙醇的分析方法。

該方法實驗過程不涉及復雜的樣品前處理過程,簡單、快速、高效,準確度、靈敏度、精密度均較高,能滿足日常醬油中4種氯丙醇的快速定性篩查和定量測定。