持續熱應激對荷斯坦牛和西荷雜交牛生理指標和機體代謝的影響

王澤棟，張林，李燁青，曾涵芳，朱靖，妥生海，韓兆玉

（南京農業大學動物科技學院，南京 210095）

荷斯坦牛具有產奶量高、耐寒卻不耐熱的特點，高溫高濕的環境極易引起其熱應激反應，造成健康狀況差、繁殖力低和高淘汰率等問題[1～5]，給養殖業帶來經濟損失。我國南方地區為亞熱帶季風氣候，夏季高溫高濕，極端氣溫高達39.7℃，年平均降水量高達1 106mm，極易造成奶牛熱應激。為了減少奶牛熱應激的發生，奶牛養殖業已在營養調控[6]、飼養管理等方面[7～9]投入了大量精力，但成效有限。近年來，研究發現，高產奶牛的長期品種內選育是造成奶牛熱敏感性上升、耐熱性能下降的重要原因之一，因此，通過多品種雜交選育兼顧產奶量和耐熱性的奶牛新品系可能是解決這一問題的重要途徑。經調查發現，西門塔爾牛具有耐熱、耐粗飼、乳脂高、使用年限長、繁殖力強等特點，屬乳肉兼用型牛。據報道，荷斯坦牛與西門塔爾牛的雜交后代表現出很好的遺傳互補和雜種優勢，特別是耐熱性、繁殖性能和乳品質方面表現突出[10～12]。因此，本研究以荷斯坦牛和西荷雜交牛為研究對象，通過檢測試驗牛生理生化、抗氧化指標和HSP70的變化，探索不同奶牛品種對長期熱應激的生理響應，以期為緩解南方地區奶牛熱應激和選育耐熱性能優良的奶牛品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗在南京衛崗乳業西崗奶牛場進行，選擇18月齡健康的中國荷斯坦牛和西荷雜交牛各8頭作為研究對象。其中，西荷雜交牛為西門塔爾牛（父本）和荷斯坦牛（母本）的雜交一代牛。飼養試驗從4月初持續到8月底，跨越非熱應激至熱應激后期，從中選4個階段采樣測定各項指標，分別為：非熱應激期（4月1～3日）、熱應激初期（6月1～3日）、熱應激中期（7月16～18日）和熱應激后期（8月26～28日）。試驗期間牛群統一舍飼散養，自由采食和飲水，日糧營養水平參照南京衛崗乳業西崗牧場飼養標準。

1.2 測定指標

1.2.1 牛舍溫濕指數（THI）

試驗期間分別測定牛舍的溫度和濕度，每個階段連續測定3d。在牛舍中部和四周距地面高1.5m的地方分別懸掛溫濕度表，每天8:00、14:00和20:00分別讀取牛舍的溫度（T，℃）和相對濕度（RH，%），并利用公式[13]計算THI，THI＝（1.8×T+ 32）-（0.55-0.55×RH）×（1.8×T-26）。

1.2.2 直腸溫度和呼吸頻率

在試驗期每階段的第3天，分別用獸用體溫計和秒表測定兩組牛的直腸溫度和呼吸頻率。

1.2.3 血清指標

在試驗期每階段的第3天，對兩組牛進行尾靜脈采血（10mL）。血液樣品靜置1h后，經3 000r/min離心15min，收集血清并置于-20℃下保存待測。

采用全自動生化分析儀和酶標儀測定血清指標。檢測指標包括總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、葡萄糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、Na+、Cl-、K+、Ca2+、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、皮質醇（COR）和熱休克蛋白-70（HSP70）。試劑盒均購自南京建成生物工程所。

1.3 數據分析

試驗數據經Excel 2010初步整理后，用SPSS 20.0的GLM程序進行統計分析，多重比較采用Duncan法。結果均用平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 試驗牛舍環境溫濕指數

研究[13]認為，當牛舍環境THI低于72時，奶牛不會出現熱應激；當THI在72～78之間時，奶牛會出現輕微熱應激；當THI在78～88之間時，奶牛會出現中度熱應激；當THI在89～98之間時，奶牛會出現極嚴重熱應激；當THI大于98時，奶牛將會死亡。由表1可知，在非熱應激期，牛舍的日平均溫度為17.33℃，相對濕度為49.67%，THI值為61.74，此環境下試驗牛不會產生熱應激。在熱應激前期，牛舍的日平均溫度為28.78℃，相對濕度為46.44%，THI值為76.19，此環境下奶牛會出現輕微熱應激；熱應激中期時，牛舍的日平均溫度達到32℃，相對濕度為47.11%，THI值為80.41，此環境下奶牛會出現中度熱應激；熱應激后期時，牛舍的日平均溫度為27.78℃，相對濕度為52.78%，THI值為75.71，此環境下奶牛會出現輕微熱應激。

表1 牛舍環境的溫濕指數

2.2 熱應激對試驗牛生理指標的影響

表2 熱應激對試驗牛直腸溫度和呼吸頻率的影響

由表2可知，和非熱應激期相比，當出現熱應激時，荷斯坦牛的直腸溫度和呼吸頻率均顯著升高（P＞0.05）；西荷雜交牛的呼吸頻率顯著升高（P＞0.05），而直腸溫度變化不顯著（P＞0.05）。此外，在整個熱應激期，西荷雜交牛的呼吸頻率均顯著低于荷斯坦牛（P＞0.05）。結果表明，持續熱應激環境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛的直腸溫度和呼吸頻率的動態變化；而西荷雜交牛能夠更好地維持直腸溫度和呼吸頻率的穩定。

2.3 熱應激對試驗牛血清生化指標的影響

表3 熱應激對試驗牛血清生化指標的影響

由表3可知，和非熱應激期相比，整個熱應激期內荷斯坦牛和西荷雜交牛的TP、GLB、ALT和AST的含量均逐漸降低（P＜0.05）。其中，ALB的含量先降低，升高到非熱應激期水平后又顯著降低（P＜0.05）；GLU的含量逐漸降低，熱應激后期時又升高到熱應激前期水平，但整個熱應激期均低于非熱應激期（P＜0.05）。整個熱應激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的LDH含量均顯著增加（P＜0.05），其中熱應激前期西荷雜交牛的LDH顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。同時，整個熱應激期CK無顯著變化（P＜0.05），但均低于非熱應激期（P＜0.05）。和非熱應激期相比，整個熱應激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的ALP含量均降低（P＜0.05），其中荷斯坦牛的ALP含量先降低后升高，而西荷雜交牛的ALP含量逐漸降低。此外，結果還顯示，熱應激中期和后期西荷雜交牛的GLB和AST顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）；熱應激前期和后期西荷雜交牛的ALT顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；熱應激中期西荷雜交牛的ALP顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05），而到熱應激后期時則顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。結果表明，持續熱應激環境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清生化指標的動態變化，其中GLB、ALT、AST和ALP兩品種間有顯著差異。

2.4 熱應激對試驗牛血清離子水平的影響

由表4可知，和非熱應激期相比，熱應激中期和后期荷斯坦牛和西荷雜交牛血清Na+含量均顯著升高（P＜0.05）。在整個熱應激期，荷斯坦牛和西荷雜交牛的Cl-逐漸升高，而Ca2+含量先升高后降低，但和非熱應激期相比均無顯著差異（P＜0.05）。和非熱應激期相比，熱應激期荷斯坦牛血清K+含量隨時間推移先降低后升高（P＜0.05），而西荷雜交牛無顯著變化（P＜0.05）。結果表明，持續熱應激環境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清離子的動態變化，但兩組牛間無顯著差異。

表4 熱應激對試驗牛血清離子的影響 (mmol/L)

2.5 熱應激對試驗牛血清抗氧化指標影響

由表5可知，和非熱應激期相比，處于熱應激期時荷斯坦牛和西荷雜交牛的T-AOC和SOD均先升高后降低（P＜0.05）；MDA先降低后升高（P＜0.05）。和非熱應激期相比，熱應激期荷斯坦牛的GSH-PX升高后降低（P＜0.05），而西荷雜交牛無顯著差異（P＜0.05）。此外，結果還顯示，熱應激前期西荷雜交牛的T-AOC和SOD顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；熱應激后期西荷雜交牛的GSH-PX和SOD顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05），而西荷雜交牛的MDA顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。結果表明，持續熱應激環境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清抗氧化指標的動態變化，而西荷雜交牛的抗氧化能力優于荷斯坦牛。

表5 熱應激對試驗牛血清抗氧化指標的影響

2.6 熱應激對試驗牛血清內分泌激素和HSP70的影響

圖1 熱應激對試驗牛血清COR和HSP70的影響

由圖1可知，和非熱應激期相比，熱應激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的COR均顯著降低（P＜0.05），且先降低后升高；其中熱應激前期兩組牛的COR顯著低于熱應激后期（P＜0.05）。和非熱應激期相比，熱應激前期和中期時荷斯坦牛和西荷雜交牛的HSP70含量均顯著升高（P＜0.05），在熱應激后期又降低至非熱應激水平。此外，結果顯示，非熱應激期、熱應激前期和中期時西荷雜交牛的COR顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；熱應激前期、中期和后期西荷雜交牛的HSP70均顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05）。結果表明，持續熱應激環境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清中COR和HSP70的動態變化，而西荷雜交牛在長期熱應激狀態下具有較好的耐熱性能。

3 討論

3.1 持續熱應激對試驗牛生理指標的影響

家畜通過自身機制的調節可使其直腸溫度在一定的范圍內上下波動。當奶牛處于熱應激狀態時，直腸溫度會逐漸升高，奶牛的行為和生理生化指標也將會發生相應的變化。本研究結果表明，熱應激中期荷斯坦牛的直腸溫度顯著高于非熱應激期（P＜0.05）；在整個試驗期西荷雜交牛直腸溫度均無顯著變化。牛在正常情況下的呼吸頻率為20次/min，廖曉霞等[14]指出，當奶牛處于輕度熱應激時，呼吸頻率為50～60次/min；中度等熱應激時呼吸頻率為80～120次/min；嚴重熱應激時，呼吸頻率可達120～160次/min。這與本試驗結果基本一致，本研究發現，與非熱應激期相比，熱應激早期荷斯坦牛呼吸頻率升高了57.26%，西荷雜交牛升高了40.17%；熱應激中期荷斯坦牛呼吸頻率升高了99.97%，西荷雜交牛升高了92.96%；熱應激后期荷斯坦牛呼吸頻率升高了47.25%，西荷雜交牛升高了41.09%。另一方面，本研究結果表明，西荷雜交牛的呼吸頻率顯著低于對應時期的荷斯坦牛（P＜0.05），且增長幅度小。有報道稱呼吸頻率過快必然導致奶牛心臟負荷增加，導致血液中CO2分壓下降，從而誘使機體發生呼吸性堿中毒[15]。由此表明，西荷雜交牛較適宜在熱應激環境下生存，其耐熱性能優于荷斯坦牛。

3.2 持續熱應激對試驗牛血清生化指標的影響

ALP是一種反映成骨細胞活性、骨生成狀況和鈣磷代謝的重要指標[16]，ALP活性降低意味著 ATP的分解減少，伴隨著血鈣和血磷含量減少。Perana等[17]研究結果表明，在熱應激環境下ALP降低，這與本研究結果一致。CK是與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶[18]，非熱應激和熱應激時期西荷雜交牛的CK比荷斯坦牛高，但差異不顯著。GLU作為重要的營養性單糖，是動物代謝活動快速供能最有效的營養素。Scharf等[19]報道，急性熱應激時肉牛血清GLU含量會升高，而慢性熱應激時則會降低。血清中TP、ALB含量直接反映了動物機體蛋白質代謝的代謝狀況。蛋白質代謝良好時，血清中TP、ALB含量較低。本研究中,奶牛在夏季因氣候變化所引起的熱應激當屬于慢性熱應激, 在該熱應激期的3個階段, 試驗牛血液中的GLU含量均呈現顯著下降，TP含量顯著下降，且西荷雜交牛TP含量下降程度更明顯，這說明熱應激對奶牛GLU代謝的影響更大，而西荷雜交牛蛋白質代謝優于荷斯坦牛。本研究還發現荷斯坦牛和西荷雜交牛熱應激狀態下血清LDH顯著升高（P＜0.05），且西荷雜交牛在熱應激前期LDH水平顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。原因可能是LDH參與了無氧酵解，LDH可能導致機體乳酸水平增加，引起酸中毒，而酸中毒會影響呼吸，使機體出現呼吸功能障礙，致機體缺氧。然而在此情況下，為保證中樞神經、心臟等重要器官的供氧，其他組織極可能在缺氧情況下采取無氧酵解方式供能。而無氧酵解運動增強時，又會使機體LDH升高，這說明西荷雜交牛抗酸中毒能力強于荷斯坦牛，抗熱應激能力更強。

3.3 持續熱應激對試驗牛血清離子水平的影響

微量元素是機體必需的組成成分，對調節機體體液的pH值和維持穩定的滲透壓具有重要的作用；另外，微量元素對應激反應中激素的合成和分泌、能量代謝、蛋白質合成、抗氧化以及免疫功能發揮都有重要作用[20～22]。血清中無機離子含量對牛的正常生理代謝具有重大意義。本研究發現熱應激期間，荷斯坦牛和西荷雜交牛血清Cl-均顯著升高，其原因可能是在熱應激早期，由于環境溫度變化，引起機體呼吸中樞興奮，使得呼吸頻率加快，血液CO2濃度下降，導致呼吸性堿中毒，從而使得腎分泌碳酸氫鹽的能力增強，腎小管對Cl-的吸收增加，最終導致血清中Cl-含量增加[23]。這與Arad等[24]研究的熱應激對雞血清電解質含量影響的結果基本一致，說明熱應激影響了機體電解質平衡。

3.4 持續熱應激對試驗牛血清抗氧化指標的影響

正常生理狀態下，機體自由基的產生和消除處于動態平衡[25]。平衡一旦被打破，過高的自由基將會導致脂質過氧化物反應，產生丙二醛(MDA)，從而造成細胞損傷。SOD是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，能及時修復因自由基造成的損傷，是機體清除自由基的首要物質。GSH-PX是機體內一種重要的過氧化物分解酶，能還原有毒的過氧化物，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害。劉吉生等[26]研究證明，機體T-AOC活性越高，對自由基清除能力越強，機體發生氧化損傷的幾率就越低。本試驗研究發現非熱應激期和持續熱應激階段對西荷雜交牛和荷斯坦?？寡趸芰Φ挠绊戭愃?；熱應激早期西荷雜交牛的TAO-C、SOD活性均顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05），在熱應激后期西荷雜交牛MDA水平顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05），而GSH-PX和SOD水平顯著高于荷斯坦牛。由此可知，西荷雜交牛相比荷斯坦牛對自由基的清除能力及還原過氧化物的能力更強，故前者的抗氧化能力在熱應激期高于后者。

3.5 持續熱應激對試驗牛血清內分泌激素和HSP70的影響

腎上腺是動物體內對環境溫度(尤其是高溫)最為敏感的內分泌腺。下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(HPA)的激活并引起的糖皮質激素(皮質醇、皮質酮、皮質素)分泌量增加，都是應激反應最重要的特征。COR是腎上腺皮質合成分泌的一種類固醇激素，參與機體多種代謝過程，有利于組織的修復。本試驗結果表明，持續熱應激導致荷斯坦牛和西荷雜交牛血清中COR含量顯著下降，這與宋小珍等[27]研究的熱應激對肉牛血清內分泌激素含量影響的結果基本一致。本試驗還發現非熱應激期、熱應激前期和熱應激中期西荷雜交牛的COR顯著高于荷斯坦牛。Alderman等[28]報道，HSP70與環境溫濕度變化密切相關，在生物熱耐受中起著主要作用。在環境變化應激時，產生的HSP70可以增強細胞對下一次有害損傷的耐受程度，維持細胞的正常生理功能代謝，提高細胞生存率。陳強等[29]報道，熱應激狀態時，奶牛體內HSP70基因的表達量會增加，說明HSP70基因的表達對機體耐熱力的產生有重要的作用。HSP70在正常細胞內表達量較低或者不表達，但是在熱應激或者其他應激源的作用下，表達量迅速增加。本試驗結果顯示，熱應激期間西荷雜交牛的HSP70顯著高于荷斯坦牛，顯示了西荷雜交牛具有的耐熱性。

4 結論

綜上所述，持續熱應激環境對荷斯坦牛和西荷雜交牛的生理指標和機體代謝的影響是相似的，而西荷雜交牛在長期熱應激狀態下可表現出較好的耐熱性能。