牦牛奶渣蛋白肽的提取及其抗氧化活性研究

王高，趙亮，林詩洋，黃艾祥

(云南農業大學食品科學技術學院，昆明 650201)

牦牛奶渣是一種少數民族特色食品，是將牦牛全乳或者提制酥油后的脫脂乳加熱到50～60℃，再加入皺胃酶或酸奶后經過濾、曬干而成，外觀呈白色，煙熏儲存后呈暗黃色，味道非常酸。奶渣中富含蛋白質、礦物質、乳糖及多種維生素，營養價值高[1]。林亞秋等[2]對牦牛奶渣營養成分進行了分析，其中脂肪和蛋白質含量分別為1.69%與63.92%，含有16種水解氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸含量的46.76%。但目前對奶渣的研究及產品的開發有限，除自食和送賓客外，主要作牲畜飼料，利用價值較低，僅有少數進入市場轉化為經濟來源。鄭旭華等[3]利用奶渣資源生產干酪素，并利用干酪素高營養、低脂肪、低膽固醇的特點生產仿制干酪、焙烤制品、糖果制品等[1,4]。施婭楠等[5]還對食品級干酪素的研制進行了研究，但關于香格里拉牦牛奶渣蛋白肽的研究未見報道。

乳蛋白肽具有抗血栓、促進礦物質元素吸收[6]、抗菌[7]等作用，其作為生物活性肽制成的功能性食品，有抗氧化、抗癌、抑菌、降血壓、免疫調節等生理功能[8]。其中抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂質氧化以及與金屬離子螯合等能力，有抗氧化作用[9]，可直接添加到食品中。目前對牦牛奶渣蛋白的蛋白肽含量、種類及活性方面的研究處于空白，本文使用酶解法對牦牛奶渣蛋白肽進行提取制備，利用響應面優化酶解工藝，確定其中蛋白肽的活性，以期為牦牛乳制品的深度開發和利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

貫筋藤蛋白酶，實驗室自制[10]；牦牛奶渣干品，采自香格里拉高山牧場。谷胱甘肽標準品，北京北納創聯生物技術研究院；茚三酮溶液、1,10-菲羅啉，三氯乙酸溶液（TCA），索萊寶公司；2,2'-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、2,2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海晶純生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單因素工藝設計

以牦牛奶渣水解度和肽得率為指標，篩選酶的添加量為6%、8%、10%、12%、14%、酶解時間為10min、30min、50min、70min、90min、酶解溫度為45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、料液比為1:50、1:70、1:90、1:110、1:130（g/mL，奶渣量：加水量），分析對牦牛奶渣多肽含量及水解度的影響。

1.2.2 牦牛奶渣蛋白肽提取工藝響應面設計

利用響應面試驗設計，并以單因素試驗結果為參考，選取酶的添加量、酶解溫度、料液比、酶解時間，進行4因素3水平的響應面試驗設計，確定最優工藝參數（見表1）。

表1 響應面試驗因素與水平設計表

1.2.3 牦牛奶渣蛋白肽測定

標準曲線繪制：分別吸取谷胱甘肽標準溶液（0.8mg/mL）0、1、2、3、4、5mL于試管中，向6支試管各加入3mL雙縮脲試劑，蒸餾水定容至10mL，60℃水浴顯色5min，冷卻至室溫后，第一管做空白對照，310 nm處測定吸光值。回歸方程為：y=4.408x-0.1324（R2=0.9993；y為吸光值，x為谷胱甘肽濃度）。

測定：取2.5mL牦牛奶渣酶解液，加2.5mL三氯乙酸溶液，均勻混合，靜置20min，再離心10min（3500rpm/min）。取上述溶液2.0mL于試管中，再加雙縮脲試劑3.0mL均勻混合，60℃水浴顯色5min，再離心（2000rpm/min，10min）取上清液，310nm處測定吸光值，計算多肽含量。

1.2.4 牦牛奶渣蛋白肽水解度測定

標準曲線繪制：稱取3mg甘氨酸標準品，蒸餾水定容至100mL，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL于試管中，加1mL茚三酮顯色液，沸水浴加熱15min，冷卻至室溫后，加入5mL 40%乙醇溶液均勻混合，放置15min，使用零號管調零，570nm處測定吸光值。回歸方程為：y=0.0335x+0.0469（3～21μg/mL，R2=0.998；x為甘氨酸濃度，y為吸光值）。

水解度測定：取適當濃度的奶渣蛋白肽水解液1mL，加1mL茚三酮顯色液，沸水浴持續加熱15min，冷卻至室溫后，加5mL40%乙醇溶液均勻混合，室溫放置15min，使用零號管調零，570nm處測定吸光值。

1.2.5 抗氧化活性測定

用冷凍干燥后的牦牛奶渣蛋白肽干粉和相同條件制備的干酪素酶解物[11]凍干粉，以相同條件進行各項抗氧化活性測定，測定時上樣量為250mg，用10mL蒸餾水溶解，以此濃度為標準測定吸光值和各項抗氧化活性，對比牦牛奶渣蛋白肽與干酪素的抗氧化活性。

1.2.5.1 總抗氧化能力測定（TEAC）

參考Moyo等[12]的方法：取250mg牦牛奶渣蛋白肽和干酪素酶解物樣品溶于10mL蒸餾水，然后分別取100μL樣品溶液于試管中并加入ABTS·+稀釋工作液3.8mL，室溫下反應6min，734nm處測定吸光度，蒸餾水替代樣品溶液作為空白，蒸餾水代替ABTS·+稀釋工作液進行調零。

式中：c為ABTS·工作液吸光度，cb為蒸餾水吸光度（調零），s為ABTS·自由基清除能力吸光度，sb為樣品干擾試驗吸光度（調零）。

1.2.5.2 還原能力測定

參考徐懷德等[13]的方法：取250mg牦牛奶渣蛋白肽和干酪素酶解物樣品溶于10mL蒸餾水，然后分別取2mL樣品溶液于試管中并加入PBS 2.5mL，加入鐵氰化鉀溶液2.5mL，50℃水浴20min，加入2.5mL TCA溶液，5000rpm/min離心10min；取上清1mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL FeCl3溶液，700nm處測定吸光度，蒸餾水代替樣品溶液進行調零。

1.2.5.3 DPPH自由基清除能力測定

參考Lin等[14]的方法：取250mg牦牛奶渣蛋白肽和干酪素酶解物樣品溶于10mL蒸餾水，然后分別取0.5 mL樣品溶液于試管中并加入2mL DPPH溶液搖勻，室溫下暗處放置10min，517nm處測定吸光值，蒸餾水代替DPPH溶液進行調零。

式中：s為DPPH·自由基清除能力吸光度，sb為樣品干擾試驗吸光度（調零），c為DPPH甲醇溶液吸光度，cb為蒸餾水吸光度（調零）。

1.2.6 數據處理

使用Excel 2010對數據進行統計分析及處理，利用Design-Expert-v8.0.6進行響應面分析。

2 提取工藝結果

2.1 牦牛奶渣蛋白肽的提取工藝

2.1.1 酶添加量對牦牛奶渣水解度和多肽含量的影響

設置不同酶的添加量，控制時間為50min，溫度為65℃，料液比為1:30，對牦牛奶渣進行酶解，測定可以看出蛋白水解度和多肽含量，結果見圖1。酶的添加量達到12%時多肽含量和水解度最高，故選取最適酶的添加量為12%。

圖1 酶的添加量對水解度及多肽含量的影響

2.1.2 酶解溫度對牦牛奶渣蛋白水解度和多肽含量的影響

圖2 酶解溫度對水解度及多肽含量的影響

設置不同酶解溫度，酶的添加量8%，時間50min，料液比1:30，對牦牛奶渣進行酶解，測定蛋白水解度和多肽含量，結果見圖2。可以看出，溫度達到65℃時多肽含量和水解度最高，故選取65℃為最適酶解溫度。

2.1.3 酶解時間對牦牛奶渣蛋白水解度和多肽含量的影響

設置不同酶解時間酶解溫度65℃，料液比1:30，酶的添加量8%，對牦牛奶渣進行酶解，測定蛋白水解度和多肽含量，結果見圖3。可以看出，酶解時間達到70min時，多肽含量和水解度最高，故確定70min為最優酶解時間。

圖3 酶解時間對水解度及多肽含量的影響

2.1.4 料液比對牦牛奶渣蛋白水解度和多肽含量的影響

設置不同料液比，控制酶的添加量為8%，時間50min，溫度65℃，對牦牛奶渣進行酶解，測定蛋白水解度和多肽含量，結果見圖4。可以看出，料液比達到1:110時多肽含量和水解度最高，故選取1:110為最佳料液比。

圖4 料液比對水解度及多肽含量的影響

綜上所述，單因素試驗中確定酶的添加量12%、酶解溫度65℃、酶解時間70min、料液比1:110為最優。

2.2 響應面優化的工藝參數

2.2.1 響應面優化及結果

根據單因素試驗結果，建立Box-Behnken Design中心組合設計試驗模型，通過擬合二次方程計算最優工藝組合及牦牛奶渣蛋白肽的最大理論提取量。選擇料液比（A）、酶的添加量（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）進行4因素3水平響應面實驗，結果見表2。

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert-v8.0.6軟件，得到牦牛奶渣水解度、多肽含量的二次方程模型為：

表2 響應面分析方案及結果

表3 回歸模型方差分析表

由表3可知，水解度及多肽含量回歸模型的顯著性檢驗P＜0.0001達極顯著水平；兩個模型失擬性檢驗P＞0.05，可認為與實際試驗擬合性充分模型失擬不顯著，說明可信度高。水解度擬合C.V值為2.13%，多肽含量C.V值為0.93%，表示精確度高。因此，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準確分析和預測酶解液的水解度及蛋白肽提取量，具有實際指導意義。該模型中，各因素對蛋白水解度影響順序為：酶解時間＞料液比＞酶解溫度＞酶的添加量，對蛋白肽提取率影響順序為：料液比＞酶解時間＞酶的添加量＞酶解溫度。

2.2.3 響應面分析

圖5 溫度與時間的交互作用對水解度的影響

由圖5可知，隨著溫度的上升，水解度呈上升的趨勢，趨于平緩后下降；酶解時間與溫度對水解度的影響相同。說明溫度與時間交互作用對水解度影響顯著，與方差分析結果相符。

圖6 時間與酶添加量的交互作用對水解度的影響

由圖6可知，隨著時間的增加，水解度呈上升趨勢，但隨后趨于平緩；而酶添加量與料液比對水解度的影響相同。說明時間與酶添加量交互作用對水解度影響顯著，與方差分析結果相符。

圖7 溫度與時間的交互作用對多肽含量的影響

由圖7可知，隨著溫度的上升，多肽含量呈上升趨勢，但隨后下降；而酶解時間對多肽含量的影響，先呈上升趨勢后下降。說明溫度與時間的交互作用對多肽含量影響顯著，與方差分析結果相符。

圖8 料液比與時間的交互作用對多肽含量的影響

由圖8可知，隨著料液比的增加，多肽含量先呈上升趨勢后下降；而酶解時間對多肽含量的影響呈上升趨勢，但隨后趨于平緩。說明料液比與時間交互作用對多肽含量影響顯著，與方差分析結果相符。

圖9 時間與酶添加量的交互作用對多肽含量的影響

由圖9可知，隨著時間的增加，多肽含量呈上升趨勢，但隨后趨于平緩；而酶添加量對多肽含量的影響，先呈上升趨勢后下降。說明時間與酶添加量交互作用對多肽含量影響顯著，與方差分析結果相符。

2.2.4 最佳參數確定和回歸模型驗證

表4 最佳參數確定和回歸模型驗證

通過響應面法得到的最佳工藝條件：酶解溫度61.52℃，酶解時間74.21min，料液比1∶107g/mL，酶的添加量為11.91%。結合實際操作的簡便性，調整為：酶解溫度65℃，料液比1∶110g/mL，酶解時間70min，酶的添加量為12%。此時水解度預測值為14.276%，多肽含量預測值為21.2095mg GSH當量/mL。在此條件下進行驗證試驗，得到水解度為（14.06±0.07）%，多肽含量為：（20.81±0.051）mg GSH當量/mL，與理論值接近，說明得到的優化參數準確性高。

2.3 牦牛奶渣蛋白肽抗氧化活性

表5 牦牛奶渣蛋白肽與干酪素酶解液抗氧化活性

由表5可知，所得牦牛奶渣蛋白肽的ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及還原能力（RP）均高于干酪素酶解液，由此可知，牦牛奶渣蛋白肽的體外抗氧化活性強于干酪素酶解液。

3 結論

經試驗得到的利用貫筋藤凝乳酶酶解牦牛奶渣提取牦牛奶渣蛋白肽的最佳工藝為：牦牛奶渣超微粉碎機粉碎→超聲破碎（300w，20min）→振蕩水浴鍋中酶解（時間70min、料液比為1:110g/mL、溫度65℃、酶的添加量為底物質量的12%）→離心（4000rpm/min，15min）→取上清液→冷凍干燥（5～10MPa，-50℃）→牦牛奶渣蛋白肽。其ABTS自由基清除能力為195.13±1.83μg GSH當量/g；DPPH自由基清除能力為61.63±1.12μg GSH當量/g；還原能力為108.6±0.49μg GSH當量/g。表明牦牛奶渣蛋白肽具有一定還原能力及自由基清除活性，是一種潛在的抗氧化劑。