葉綠體色素的提取和分離實驗的改進

陳靜碧

摘 要：本文圍繞縮短實驗周期這一視角，從提取方法、提取溶劑與層析方法三方面對傳統的分離葉綠體色素的方法進行改進，從而對提取和分離葉綠體色素的方法進行優化，以期為高中生物教學更好地實施提供參考。

關鍵詞：葉綠體色素;提取;分離;層析

1.問題的提出

葉綠體色素的提取和分離實驗是高中生物教學中一個重要必做的實驗。教材做法如下：稱取5g新鮮的綠色葉片剪碎（或菠菜干粉），放入研缽中，向研缽中放入少許二氧化硅和碳酸鈣，再加入5mL95%乙醇，進行迅速、充分地研磨，然后將研磨液倒入小玻璃漏斗中過濾，將濾液收集到小試管中，供隨后進行的紙層析色素分離實驗。實際操作下來，實驗的效果往往不太理想，具體表現如下：（1）提取過程費時又費力：一是研磨有難度且費力，二是乙醇易揮發，研磨液容易變成成研磨糊;三是過濾介質易吸附色素導致色素濃度和提取液體積下降。（2）層析分離效果不理想，一是色素濃度不足，二是無胡蘿卜素色素帶或不明顯，三是濾液細線費時條帶成波狀。鑒于以上主要原因，葉綠體色素的提取和分離實驗在進行學生分組的時候時常出現實驗結果不理想和未完成;常規課堂上無法進行實驗演示。

2.原理分析

葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素2類，主要包括葉綠素a（C55H72O5N4Mg）、葉綠素b（C55H70O6N4Mg）、β-胡蘿卜素（C40H56）和葉黃素（C40H56O2）4種。葉綠素a和葉綠素b為吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，易溶于弱極性的有機溶劑中。胡蘿卜素是一種橙色天然色素，屬于四萜類，有α、β、γ3種異構體，其中，β異構體含量最多。很多人認為分離效果取決于分離的操作，其實分離效果很大程度還取決于提取過程的操作。胡蘿卜素不溶于水，在乙醇、丙酮中溶解度不如在乙酸乙酯中溶解度大。葉黃素為一種黃色色素，與葉綠素同存在于植物體中，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶于乙醇，在乙醚中溶解度較小。從上述提取原理可以看出，弱極性有機溶劑對葉綠素的溶解度大，對胡蘿卜素溶解均不夠理想。增加萃取步驟可以提高色素提取液濃度，易發生顯著的色素熒光現象。通過色素溶液顏色深淺、熒光現象程度可以定性反應色素提取的質量。

3.實驗方法步驟

3.1葉綠體色素提取實驗：

（1）菠菜去粗大葉脈，45℃烘干碾成干粉狀（或碎末）

（2）取0.5g菠菜粉末，加入2mL乙醇-乙酸乙酯2∶1（V/V）溶液，少許碳酸鈉粉末，80℃以上水浴加熱（加熱至試管內乙醇沸騰）2min。

（3）乙醇-乙酸乙酯色素提取液中加入1ml層析液進行萃取，觀察明顯的色素熒光現象。

3.2葉綠體色素分離實驗：

（1）取兩塊干凈的載玻片，選擇其中的一塊滴兩滴色素提取液，然后在另一塊載玻片上將提取液推平，制成涂片。

（2）將濾紙條對折，用對折后的濾紙把載玻片上的色素擦干凈（濾紙條垂直色素涂片，使折橫與其接觸），后將對折線反折后拉平，濾紙條下端會出現一條深綠色的濾液細線。

（3）將濾紙條放入針筒制成的層析柱中，通過活塞推拉促進層析液在濾紙條上擴散。觀察色素分離結果。

由圖1可知，試管2色素溶解快于試管1，表明乙酸乙酯促進葉綠體色素的溶解;圖2紅色熒光現象顯著;圖3中2號濾紙條的色素帶濃于1號，胡蘿卜素最顯著;以上結果表明，乙醇-乙酸乙酯煮沸法有助于提升色素濃度。圖4從胡蘿卜素條帶的位置看，2號（針筒層析柱組）的跑帶速度快于1號（普通層析柱組），表明針筒抽濾操作可減少層析時間。

4.討論與反思

與浙科版教材方法相比，避免了原實驗程序繁瑣、耗時長、所用材料用量多、濾液渾濁等缺點。本方案本著易于推廣的思路，通過方法步驟材料試劑的優化，節約了時間節省了成本，可用于課堂演示實驗，層析結果等待期間，教師可穿插實驗原理講解。

4.1耗時較短，可用于課堂演示。

一是本實驗提取色素不需研磨不需要過濾，提取色素液的時間只需2～3min，同時避免大量的清洗工作，實驗結果表明色素提取液濃度高，活性好。二是用涂片的方法改機畫濾液細線，一步到位，避免了反復劃線不斷風干的繁瑣操作，不同學生操作結果表明，制作涂片畫線的效果明顯;三是采用注射抽濾加壓的方法，雖然效果沒有明顯改善，但層析的速度快于層析柱自然層析。綜上，本實驗可比教材方法提速15min以上，具體時間因操作者而異。

4.2色素濃度加大。由于加入乙酸乙酯增大了胡蘿卜的溶解，由于色素被萃取濃縮，教師可讓學生觀察明顯的色素熒光現象，激發學生進一步探究的興趣。容易吸取到試管上層經萃取濃縮的色素溶液，經劃線、層析后色素分帶清晰，分離效果十分顯著。乙酸乙酯時化學實驗室常備用藥，易于獲得，且低毒，增加萃取步驟實現了跨學科知識的整合，較好的實踐了新課改的理念。另外，在材料的選擇上，很多植物的葉片，如大蒜、大葉黃楊等植物，取材方便，但太難以研磨，幾乎無法得到提取液。采用乙醇沸水浴法均易得到，受季節、氣候和地域等因素影響。此實驗以乙醇煮沸加熱，效果才能明顯。

4.3耗材少，體現綠色實驗。一是利用菠菜干粉進行乙醇沸水浴法，加入碳酸鈉和不加碳酸鈉差異不大，故可同時省去碳酸鈣和二氧化硅的使用;二是教材中建議研磨過程中加入2-3mL95%乙醇，在實際操作中因菠菜干粉的吸收、乙醇自身揮發、過濾介質對色素溶液的吸收等原因，一般需要10mL，一些學生用量更多，本實驗僅需2mL;三是水浴法分層明顯，不需要過濾裝置的準備;但是需要準備水浴鍋等公用的加熱裝置。