生物標志物與抗腫瘤藥物研發

吳家睿

腫瘤患者廣泛存在著個體之間的差異以及個體的腫瘤組織內部差異，需要通過生物標志物來區分和確定對藥物具不同響應的個體。因此，生物標志物在抗腫瘤藥物研發中起著重要的作用。

抗腫瘤藥物研發是當前創新藥物研發最活躍的領域，也是生物標志物最能夠體現“英雄用武”之領域。腫瘤患者不僅廣泛存在著個體異質性（inter-tumor?heterogeneity），而且在每個個體的腫瘤組織中也普遍存在內部差異（intra-tumor?heterogeneity），因此需要通過生物標志物來區分和確定對藥物具不同響應的個體。據統計，如果在腫瘤臨床試驗中納人正確的生物標志物，可將藥物最終獲批的可能性提高10%到25%。

美國食品與藥品管理局（Foodand?Drug?Administration，FDA）在2018年度批準了多個基于伴隨診斷的腫瘤分子靶向藥物，例如用于治療攜帶ALK（間變性淋巴瘤激酶）基因重組的非小細胞肺癌的藥物勞拉替尼（lorlatinib）。隨后FDA又進一步推出一項伴隨診斷分類標簽指南草案，主要針對個體化抗腫瘤藥物伴隨診斷的分類標簽，即在特定情況下，如果試驗證據足以證明某一伴隨診斷產品適用于一組或一類治療藥物，則該診斷產品的預期用途或適應證將涵蓋這一類藥物，而不限于單個藥物。這表明FDA已經把生物標志物視為抗腫瘤藥物研發和應用的主要基礎。

最主要的腫瘤生物標志物：基因變異

腫瘤的形成和發展源于大量的基因變異，每種類型的腫瘤往往都具有成百上千的基因變異。因此，發現腫瘤細胞基因組的DNA序列變異被公認是抗擊腫瘤的關鍵。美國國立衛生研究院（National?Institutes?of?Health，NIH）在2006年啟動了一個名為“癌癥基因組圖集”（The?Cancer?Genome?Atlas，TCGA）的項目，通過該項目的實施，已在肺癌、乳腺癌等50種癌癥的上萬個樣本中發現近1000萬種遺傳變異。目前學術界達成這樣一個共識：防治腫瘤的首要任務是了解腫瘤細胞的基因變異。

美國國家癌癥研究所（National?Cancer?Institute，NCI）在2017年進行了一次全國癌癥精確醫學問卷調查（National?Survey?of?Precision?Medicinein?Cancer?Treatment），調查結果顯示：在參加調查的美國腫瘤醫生中，高達75.6%的人都在用“二代測序”（next-generation?sequencing，NGS）技術指導腫瘤治療，其中34.0%的醫生經常使用NGS檢測來指導晚期難治性腫瘤患者的治療決定，29.1%的醫生通過NGS檢測決定腫瘤患者是否滿足臨床試驗的標準，17.5%的醫生用NGS檢測來決定是否進行超適應證用藥。

基因測序目前已成為一個巨大的產業。根據美國聯合市場研究機構在2017年年底發布的分析報告，2016年全球DNA測序市場產值約為52億美元，預計2023年將達到183億美元。顯然，腫瘤患者的基因檢測需求在這個測序市場中占有重要的份額。例如，美國已經有數百萬女性接受了抑癌基因BRCA1的基因變異檢測，以判定個體患乳腺癌或卵巢腫瘤的風險程度。此外，越來越多的腫瘤基因檢測產品進人臨床應用領域。例如，2017年12月，美國FDA批準首個腫瘤基因檢測盒上市，這款由波士頓一家名為Foundation?Medicine生物公司制造的產品“Foundation?One?CDx"，可通過對324個特定腫瘤基因的深度測序來檢測變異情況.對肺癌、乳腺癌、直腸癌和卵巢癌等四種常見惡性腫瘤進行早期診斷。

隨著科學技術的迅速發展，基因測序技術也正在發生著重大的改進。由于NGS技術的測定序列“讀長”較短，通常在200～300堿基對;研究者又開發出第三代測序技術，其“讀長”平均可達10千堿基對以上。研究者利用第三代測序技術能夠進一步揭示腫瘤細胞基因組的變異特征和復雜性。例如在一項針對乳腺癌細胞系的測序工作中，研究者利用第三代測序技術鑒定出17313個長度大于50堿基對的基因組結構變異，包括插入、缺失、重復、倒位和其他特殊變異類型;而用NGS技術只檢測到4174個基因組結構變異”。可見第三代測序技術在基因組結構變異檢測上具有更高的靈敏度與準確度。

雖然研究者利用先進的測序技術發現了腫瘤細胞中大量的基因變異，但是對這些基因變異的生物學意義或在腫瘤發生發展過程中的病理機制方面仍知之甚少。例如研究者已經在與乳腺癌或卵巢癌高度相關的抑癌基因BRCA1的13個外顯子上發現近4000種單核苷酸變異（single-nucleotide?variant，SNV），但大部分SNV的生物學含義或者在癌變中的作用并不很清楚。不久前研究者采用CRISPR一Cas9基因組編輯技術系統性地評估了整個BRCA1的外顯子序列上幾乎所有的SNV，鑒定出400多個SNV是非功能性錯義突變（non-functional?missense?mutation），同時發現了能抑制BRCA1表達的近300個SNV。可以認為，確定基因變異在腫瘤形成中的作用依然是當前基因檢測領域的主要挑戰。

需要指出的是，即使知道了腫瘤細胞里基因突變的作用或功能，也并不意味著能給患者帶來益處。一項對5000多例非小細胞肺癌患者的基因檢測方式與生存率的相關性研究揭示，那些接受了30種基因以上的“廣譜基因”檢測的患者與只接受了單純的EGFR/ALK檢測的患者，在12個月生存率上沒有顯著差異3。研究者發現，除了針對EGFR/ALK相關的靶向治療外，在攜帶其他類型基因突變的患者中只有4.5%的人得到相應的靶向治療3。換句話說，檢測到了有臨床意義的突變不等于獲得了有效的治療藥物。當前的基因檢測能力已經遠遠超過人們研發靶向藥物的能力。

追蹤腫瘤動態變化的利器：液體活檢

腫瘤最具挑戰性的特點除了高度異質性之外就是高度可變性，即腫瘤細胞隨著病程或者治療過程時刻發生著各種各樣的變化。這種特點使得傳統的病理診斷或者影像診斷難以滿足腫瘤治療的需求，迫切需要一個能夠無創地動態跟蹤腫瘤細胞變化的檢測技術。液體活檢技術就是一種能滿足這種需求的檢測技術，該技術可能是近年來在臨床上，尤其在腫瘤診治領域發展最快的檢驗方法，曾被《麻省理工科技評論》評為“2015年十大突破技術”。該技術通過非侵入性方式檢測血液或尿液等體液中特定的生物標志物，從而對癌癥等疾病做出相應的診斷。目前腫瘤液體活檢的分析重點是血液中的循環腫瘤細胞（circulating?tumor?cell，CTC）、循環腫瘤DNA（circulating?tumor?DNA，ctDNA），以及腫瘤細胞分泌的含有核酸、蛋白質和脂質的囊泡狀外泌體（exosome）。

對血液中的CTC和ctDNA進行檢測是目前臨床應用中最常見的液體活檢形式，尤其是ctDNA，它作為監測腫瘤發生發展過程和藥物響應的生物標志物具有巨大的潛力。首先，通過對ctDNA的分析，能夠獲得腫瘤基因組的綜合性信息，并找到在病理組織活檢中常常無法發現的體細胞突變，從而用于判斷腫瘤對藥物的敏感性或耐藥性。比如從非小細胞肺癌患者的ctDNA中檢測到EGFR基因突變，就可用于指導臨床用藥。此外，通過對ctDNA的深度測序，可以發現只在部分腫瘤細胞中出現的基因突變，從而有助于解決腫瘤組織的內部異質性問題。

雖然液體活檢技術在臨床上得以迅速推廣，但該方法的臨床有效性并沒有得到很好的研究。美國臨床腫瘤學會和美國病理醫師學會，針對已發表的1338篇關于ctDNA臨床檢測的論文，從分析有效性（analytical?validity）、臨床有效性（clinical?validity）和臨床實用性（clinical?utility）三方面進行了系統分析15]。分析結果指出：目前發表的與ctDNA分析有效性相關的研究都是通過比較腫瘤組織和血漿中致病突變的一致性得出結論，但實際上有很多生物學因素也會影響這種一致性;雖然ctDNA檢測到的陽性結果可以用于指導臨床治療，但是檢測結果為陰性的患者仍然需要進行腫瘤組織檢測，因為這類患者在組織病理檢測中可能是陽性結果。所以，盡管當前研究者很看重ctDNA的檢測潛力，但是在付諸日常臨床實踐時，尚需要更多的臨床有效性證據。

液體活檢技術除了關注血液中的CTC和ctDNA外，還涉及血液中RNA和蛋白質等其他組分。血液蛋白質在過去的臨床實踐中已被視為重要的生物標志物來源，其中就有數十種腫瘤抗原或腫瘤分泌蛋白被廣泛用于診斷腫瘤發生或判斷治療效果和預后，近年來研究人員利用蛋白質組技術進一步發展出針對血液蛋白質的液體活檢技術。顯然，如何將血液中各種組分充分用于腫瘤液體活檢是研究者需要認真考慮的問題。

腫瘤的分子分型：基于生物標志物的兩種策略

傳統的腫瘤分類是基于解剖位置和病理性狀，屬于“粗放型”。由于腫瘤存在高度的異質性，相似病理形態的腫瘤往往表現出不同的臨床癥狀和不同的藥物響應。隨著精確醫學的出現，研究者逐漸將基因和蛋白質等生物大分子作為腫瘤分類的基礎。其中，分子分型的結果在抗腫瘤藥物的研發中發揮了重要作用。例如，在原創藥拉羅替尼（larotrectinib）[原肌球蛋白受體激酶（TRK）的小分子抑制劑]的臨床試驗中，人選的患者涉及13種不同的實體瘤類型，但每位患者都有一個共同的分子標志物——TRK基因的融合變異。

目前腫瘤細胞的基因變異信息是腫瘤分子分型最常用的分子標志物;美國在啟動TCGA項目時，從其名稱就可看到是把腫瘤的分類目標定在腫瘤細胞的基因組測序上。但是，研究者很快就認識到，單一的基因變異分子特征很難應用于大部分癌癥類型。隨著TCGA項目的推進，美國NCI又啟動了一個針對腫瘤蛋白質組的項目——“The?Clinical?Proteomic?Tumor?Analysis?Consortium”（CPTAC），不僅要獲得腫瘤細胞的蛋白質組數據，而且要把基因組和蛋白質組數據整合在一起進行分析。研究者為此專門創造了一個詞“蛋白質組一基因組學”（proteogenomics）。該項目的第一篇研究論文于2014年發表。在此項研究中，研究者首先將已被TCGA進行過基因組測序的95個人類結直腸癌樣本做了蛋白質組分析，然后將這些蛋白質組數據和對應的基因組數據進行整合，進而更完整地揭示了這些腫瘤細胞的分子特性。

隨著研究工作的深人，人們發現不同類型的生物大分子乃至其化學修飾在腫瘤鑒定和分類中都有著特定的價值。例如不久前發表的一項工作，利用改進的液體活檢技術分析血液中游離DNA（cell-free?DNA，cfDNA）的甲基化信息，成功進行了早期腫瘤檢測，并做了正確的分類。

顯然，要實現腫瘤的精確分子分型，并用來指導個性化抗腫瘤藥物的研發，研究者必須改變那種依賴于單一類型生物標志物乃至單個分子標志物的簡單化思路，發展基于多個生物標志物指標的整合型評估技術，即通過建立特定的評估模型，確定不同指標之間的權重分配.進行多指標相互關聯分析，從而確定個體患者的腫瘤分子特征、預測其可能的藥物響應情況。例如，TCGA項目的研究者在腫瘤分子分型方面，不僅利用了腫瘤細胞基因組序列的信息，而且還整合了相關的染色體非整倍性、DNA甲基表達譜、基因表達譜、microRNA表達譜和蛋白質表達譜等數據，從而將傳統分類確定的33種腫瘤類型按照這種多組學整合的分子分型方法分為28種類型。

腫瘤分子分型的目標，不僅要找出具有相同病理形態的腫瘤的不同分子特征，還要提煉出不同病理形態的特定類型腫瘤的共同分子特征，即構造出一種稱為“泛腫瘤”（pan-cancer）的類型。不久前，美國研究人員采集了近1700例年齡20歲或以下的包括6種白血病和實體瘤的青少年腫瘤（paediatric?cancers）樣本，檢測了其全基因組、全外顯子組和轉錄組序列，發現了一系列青少年腫瘤基因組所共有的特征，比如在這些樣本中找到142個驅動基因，其中只有45%能夠在成人各種類型的腫瘤中找到。又例如，研究者收集了卵巢癌、子宮內膜癌.宮頸癌、子宮肌瘤和乳腺癌共2500多例樣本，對這些樣本的基因組、表觀遺傳組、轉錄組以及蛋白質組等多組學數據進行了整合，發現了16種與臨床相關的分子特征，在此基礎上進行了泛婦科腫瘤綜合分子分型，得到與預后和靶向治療顯著相關的5種分子亞型。

由此可以看出腫瘤分子分型的兩種主要策略：基于特定分子標志物的“跨瘤種”分子分型，以及基于多組學數據整合的“泛腫瘤”分子分型。前者注重不同腫瘤類型間的分子個性特征，后者注重具有特定生物學共性（如“青少年腫瘤”或“婦科腫瘤”）的不同腫瘤類型間的分子綜合信息。兩者都超越了基于組織病理形態特征的傳統腫瘤分類，從分子層面去揭示各種類型腫瘤之間的內在聯系。

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關鍵詞：生物標志物?腫瘤?藥物研發