LuxS基因對變鏈菌生物學性狀的硫代謝影響

張耀超 唐成芳 周芳 張琳梅

摘 要：目的：比較不同條件培養基中變鏈菌標準株和LuxS基因突變株的生長差異，分析LuxS基因在變鏈菌硫代謝方面的功能。方法：采用營養補充實驗在硫限定條件下培養兩菌株并通過測定不同時期吸光度值來比較兩者的生長差異。結果：加入半胱氨酸后突變株明顯增長，但仍未及標準株水平;分別加入蛋氨酸及SAH后，突變株明顯增長且達到標準株水平;當加入上清液后突變株有所增長并超過標準株水平;而加入SAM后兩菌株的生長均降低。結論：LuxS基因在變鏈菌生長過程中發揮著重要的硫代謝作用。

關鍵詞：變鏈菌;LuxS基因;硫代謝

變鏈菌（S.mutans） 是革蘭氏陽性微需氧菌，在人類口腔微環境中占有重要的生態地位，是最重要的致齲菌[1]。有學者研究沙雷菌MR-1中LuxS的作用，結果顯示LuxS突變株改變生物膜的形成，主要是通過干擾活性甲基周期（AMC）。LuxS蛋白為合成酶，它能合成LuxS系統的信號分子即AI-2信號分子[2]。本研究采用變鏈菌LuxS基因突變株，在硫限定條件下通過營養補充實驗對標準株和突變株進行生長吸光度值的測定比較，以期為進一步研究打下基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養基

變鏈菌（S.mutans）Ingbritt C （血清C型） 國際標準株，本實驗室成功構建并保存的LuxS基因缺失突變株[3，4]，以下簡稱突變株。TSA固體培養基，TSA-Eymr固體培養基（加入紅霉素至終濃度10μg/ml），牛心腦浸液BHI液體培養基。

1.2 主要試劑和儀器

蛋氨酸，半胱氨酸，SAM，SAH（sigma，美國），PBS緩沖液，標準株上清液（本實驗室配置并保存），超凈工作臺，高速臺式離心機，電熱恒溫水浴箱，隔水式恒溫培養箱，紫外線可見光分光光度計（BECKMAN公司，美國），R200電子天平，進口96孔微量板。

1.3 實驗方法

制備限定化學成分的條件培養基，在BHI液體培養基中分別加入半胱氨酸10mg/ml，蛋氨酸100μmol，SAM50mg/ml，SAH1mg/ml（sigma），10%標準株的無菌上清液。將兩種菌株常規復蘇，提純鑒定為純菌后，分別挑取單菌落轉種于BHI液體培養基及BHI-Eymr液體培養基中，離心棄上清液，用PBS緩沖液混勻于紫外分光光度計600nm處調至A≈0.1備用。將已配制好的條件培養基一式六份每孔200μL加入到無菌96孔板中，以等量BHI液體培養基為空白對照組，在各種條件培養基中分別加入100μL兩種菌株菌懸液，一式三份。厭氧條件下培養24h，48h后于紫外分光光度計600nm處測定吸光度值A并分別記錄下來。

統計學分析應用SPSS13.0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間計量資料的比較采用t檢驗，P < 0.05有統計學意義。

2 結果

3 討論

本實驗通過加入標準株上清液發現突變株的生長吸光度值增長，彌補了因LuxS基因缺失引起的AI-2的表達缺陷，這與Yoshida等研究者們的發現類似。

通過外源性加入一定濃度的蛋氨酸及SAH培養24h后能部分彌補突變株的生長，48h后甚至超過標準株生長水平，這可能與LuxS基因缺失后干擾了AMC，突變株失去利用高半胱氨酸和潛在參與甲基化反應的能力相關[4]。已有研究證實LuxS基因在鼠李糖乳桿菌GG中發揮了重要的硫代謝功能，其基因序列表明LuxS是與硫氨酸代謝相關的主要代謝酶。在AMC中，蛋氨酸是細胞內生成甲基和循環利用高半胱氨酸的關鍵代謝物[5]，LuxS缺失使作為唯一硫源的蛋氨酸生成能力降低。營養補充實驗表明LuxS基因缺失是造成變鏈菌代謝缺陷的原因，加入一定半胱氨酸可以不同程度補償突變株的生長缺陷，添加該成分刺激突變株生長是由于LuxS基因缺失導致了變鏈菌對代謝循環中更多營養必需物質的需要。通過補充AMC中相關的代謝物對兩菌株生長狀況的分析表明LuxS在變鏈菌生長過程中發揮著重要的硫代謝作用。在本研究中，當加入一定濃度的SAM時，兩菌株的生長受到抑制可能是由于外源性加入SAM不能滲透到變鏈菌細胞內，而LuxS基因缺失引起了SAM在細胞間積累加強，在其他菌種中還未見相關報道，其機制還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]SHARMA A， AGARWAL N， ANAND A，et al. To compare the effectiveness of different mouthrinses on Streptococcus mutans count in caries active children[J].J Oral Biol Craniofac Res，2018 ，8（2）：113-117.

[2]ZHENG H M，MAO Y L，ZHU Q C，et al.The quorum sensing regulator CinR hierarchically regulates two other quorum sensing pathways in ligand-dependent and-independent fashions in Rhizobium etli[J].J Bacterial，2015，197（9）：1573-1581.

[3]張耀超，韓育植，韓福勝.變異鏈球菌LuxS基因缺陷突變株的構建及其生物膜結構的初步觀察研究[J].牙體牙髓牙周病學雜志，2012，22（6）：309-313.

[4]Bodor，A，B.Elxnat，Thiel V，et al.Wagner-Dobler I Potential for LuxS related signaling in marine bacteria and production of autoinducer-2 in the genus Shewanella[J].BMC Microbiol 2008，8：13.

[5]Deric R.Learman，Haakrho Yi，Steven D.Brown，et，al.Involvement of Shewanella oneidensis MR-1 LuxS in Biofilm Development and Sulfur Metabolism.[J].Appl Environ Microbiol.2009，75（5）：1301-1307.

基金項目：

陜西省教育廳專項科研計劃項目， （項目編號： 18JK0656）