昭通市腹瀉患兒輪狀病毒檢測和基因型分析

木國法

[摘要]目的：研究2017年6月月-2018年12月云南省昭通市腹瀉患兒輪狀病毒感染的的分子流行病學，為研制適合本地區的Rv疫苗提供參考依據。方法：收集昭通市第一人民醫院兒科2017年6月-2018年12月腹瀉患兒的糞便標本106份，用“膠體金法”檢測A組RV抗原，逆轉錄棗合酶鏈反應（RZ-PCR）法擴增VP7、VP4，對RT-PCR陽性標本進行測序分型。結果：106份標本中，30份檢測到輪狀病毒抗原。陽性率為28.3%;對30份陽性標本進行G基因型測序分型，測序成功22例，G9型20例（90.9%），G2型2例（9.1%）。30份陽性標本進行P基因型測序。測序成功30例，P8型23例（76.7%），P4型7例（23.3%）。結論：昭通市RV腹瀉患兒以G9型為主要流行病毒株。P基因型以P8型為主。G型和P型的組合以G9P8型為主。

[關鍵詞]輪狀病毒;基因分型;腹瀉

[中圖分類號H R725.1 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）06-0252-01

A組輪狀病毒是引起嬰幼兒嚴重腹瀉的主要病原體。世界衛生組織統計每年大約引起61.1萬嬰兒和兒童死亡。在發展中國家，小兒腹瀉是嬰幼兒死亡的主要原因，僅次于肺炎，約90%的RV感染死亡病例發生在亞洲和非洲的發展中國家。我國每年有4萬嬰幼兒因RV性腹瀉而死亡。目前尚無治療RV腹瀉的特效藥，主要采用對癥治療，糾正脫水，維持電解質平衡，因此預防極其重要。

由于RV的型別眾多且多變，因此病流行學相當復雜，各地區各時期流行株不同，因此廣泛的RV構筑監視網，RV流行株的變化動態監測疫苗開發有必要的數據支持。本研究選擇常見A組的6種RVVP7基因型基因型（g）的特異性引物和A組的5種RVVP4基因型（p基因型）特異引物，RT-PCR技術對嬰幼兒RV腹瀉的P和g基因型的分子流行病學研究，為了開發適合本地區的安全有效的RV疫苗提供流行病學依據，并對RV的流行病學檢測提供科學數據。

1資料與方法

1.1一般資料：

收集2017年6月-2018年12月昭通市第一人民醫院兒科腹瀉患兒大便標本共106例。均為符合臨床診斷標準的腹瀉患兒。

1.2主要試劑：

A群RV診斷試劑盒，小量柱離心式/液體樣品RNA/DNA抽提試劑盒，PCR擴增試劑，PCR產物鑒定利用瓊脂糖凝膠電泳法。

1.3試驗方法：

（1）RV的RNA提取及檢測：采用“膠體金法”檢測A組RV抗原，其操作步驟嚴格按照試劑盒操作：檢測陽性標本用病毒/液體樣品的RNA/DNA抽提試劑盒抽提RNA，將裝有RVRNA的1.5.mL離心管置于-70℃冰柜備用。（2）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）擴增RV的VP7全長基因及巢式-聚合酶鏈反應（net-PCR）VP7血清型分型。（3）巢式-聚合酶鏈反應（net-PCR）進行VP4血清型分型。

1.4統計學處理：

數據采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示。

2結果

2.1.RV檢測結果以及RV感染的年齡和性別分布在elisa中測量方法檢測結果顯示，糞便樣本106人中，取30份糞便樣本，陽性樣本為28.3%。男女患兒比例2.0比1的差異沒有統計意義（P>0.05）。7-18月的年段患兒中RV陽性率最高（73.9%），其他年段是0-6個月（7.0%），19-36個月（16.3%），37-60個月（2.8%），以此進行了比較，顯示出了統計學上的意義（P<0.05）。

2.2.RV感染的時間分布特點RV腹瀉全年發病，流行高峰在9-12月份。

2.3.G9型成為主要流行病毒株，P基因型以P8型為主，G型和P型的組合以G9P8型為主。

3討論

2017年6月-2018年12月昭通市腹瀉患兒RV陽性率28.3%，RV檢出率在男性患兒和女性患兒之間無差異。

RV的VP7蛋白是位于其外殼的主要蛋白結構，目前已有27個G血清型和35個P基因型被確定。我國20世紀90年代RV感染以G1型為主，2001年以來G3型成為國內主要流行株。自1994年國內學者錢淵等首次報道G9型感染病例，近年來國內G9病例陸續出現報道，本研究顯示昭通市2017年6月-2018年12月RV毒株以G9為主要流行株，G9作為以前稀少的流行株成為優勢株，并且在昭通市流行中占主導地位。目前RV疫苗主要是針對4個主要的流行優勢株（G1-G4）來控制RV感染，而CO型RV流行越來越普遍，很有可能成為繼G1-G4之后第5種最為流行的血清型，RV疫苗的研制就應該引入所有常見的血清學中的中和抗原，這促使人們認識到G9型輪狀病毒感染的流行病學意義。

RVVP4是組成RV的對蛋白酶敏感的非糖基化蛋白，目前引起嬰幼兒腹瀉的P基因型多為P8和P4型，本研究RVVP4基因分型結果顯示：昭通市2017年6月-2018年12月P基因型以P8型為主，P4型次之。