加味大柴胡湯對(duì)阻塞性黃疸老年大鼠TRPC1表達(dá)的影響

李雪 張瑋琛

[摘要]目的探討加味大柴胡湯在臨床上輔助治療老年阻塞性黃疸的理論機(jī)制。方法通過結(jié)扎膽總管的外科手術(shù)方法建立阻塞性黃疸老年大鼠模型，實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、加味大柴胡湯組，予以相應(yīng)干預(yù)，分3、7、10d共3個(gè)時(shí)間段，每組10只SPF級(jí)老年SD大鼠，在各時(shí)間段取老年大鼠肝組織及心臟血，檢測(cè)AST、ALT及TBA;采用鈣離子試劑盒檢測(cè)老年鼠肝組織勻漿鈣離子濃度;采用Westem Blot法檢測(cè)老年鼠肝組織TRPC1蛋白的表達(dá)，采用Tunel法觀察肝細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果造模成功后各時(shí)間點(diǎn)模型組、加味大柴胡湯組與假手術(shù)組比較，ALT、AST、TBA和Ca²⁺濃度均升高，且模型組上升更明顯（P<0.01），模型組、加味大柴胡湯組的TRPC1的蛋白含量也均高于假手術(shù)組（P<0.01），且加味大柴胡湯組肝細(xì)胞的凋亡率低于模型組（P<0.01）。結(jié)論梗阻性黃疸老年大鼠TRPC1表達(dá)明顯升高，加味大柴胡湯下調(diào)TRPC1的表達(dá)，可能是其降低鈣超載，減少肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]阻塞性黃疸;老年大鼠;加味大柴胡湯;細(xì)胞凋亡;TRPC1

[中圖分類號(hào)]R285.5;R256.41[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.008

阻塞性黃疸（obstructive jaundice）是由于肝外或肝內(nèi)膽管部分性或完全性阻塞，使膽汁不能排人十二指腸而返流人血，致皮膚、鞏膜和黏膜等機(jī)體組織黃染。阻塞性黃疸首先對(duì)肝臟本身造成損傷，若未得到及時(shí)治療，全身各個(gè)器官都會(huì)發(fā)生不同程度的損害。隨著我國老年人口的增加，老年人患阻塞性黃疸的比例也增加。老年患者因機(jī)體功能的退化，阻塞性黃疸發(fā)生時(shí)其臨床癥狀并不典型，故而易延誤診斷及治療，可一旦癥狀加重，又因合并多種并發(fā)癥，手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)和術(shù)后的死亡率均增高。現(xiàn)有研究已證實(shí)阻塞性黃疸時(shí)膽汁排出受阻以及繼發(fā)的內(nèi)毒素血癥是造成其各種病理生理改變的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。若不及時(shí)解決相關(guān)梗阻問題，肝臟最終會(huì)隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而萎縮，肝細(xì)胞最終甚至?xí)觥９蕦?duì)阻塞性黃疸的老年患者如何進(jìn)行術(shù)前減黃，從而減輕代表性的肝損害成為臨床的棘手問題，但國內(nèi)尚未對(duì)此開展深入研究。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)黃疸的最早認(rèn)識(shí)來自《黃帝內(nèi)經(jīng)》，“濕熱相交，民病癉也……溺黃，赤安臥者，黃疸……目黃者，曰黃疸”。后《金匱要略》又指出：“黃家所得，從濕得之。”故中醫(yī)學(xué)對(duì)黃疸病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)強(qiáng)調(diào)濕邪為患，阻塞性黃疸由于肝郁氣滯，肝膽濕熱，氣血瘀滯，膽汁瘀積，結(jié)聚而成石，致使“中清之腑”成為不清之腑，氣機(jī)運(yùn)行不暢而郁積肝膽。大柴胡湯出自《傷寒雜病論》，有和解少陽、攻下熱結(jié)之功。加味大柴胡湯是根據(jù)《金匱要略》在大柴胡湯中加入茵陳、金錢草，諸藥配伍，既可疏利肝膽之氣滯，又可蕩滌腸胃之實(shí)熱。謝毅通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加味大柴胡湯可減輕阻塞性黃疸大鼠因內(nèi)毒素造成的肝損傷：余水平也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)加味大柴胡湯可影響參與梗阻性黃疸大鼠膽汁酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)而緩解肝臟能量代謝障礙。除此之外，加味大柴胡湯是否可通過其他途徑減少肝損害肝細(xì)胞凋亡與鈣超載密切相關(guān)，鈣內(nèi)流又與鈣庫操縱性鈣通道（store-oper-ated Ca²⁺entry，SOCE）的介導(dǎo)有關(guān)，TRPC1是肝細(xì)胞上SOCE的主要成分，TRPC1在此過程中是否起作用？本文采用阻塞性黃疸老年大鼠模型觀察加味大柴胡湯對(duì)肝臟TRPC1表達(dá)及肝損傷的影響，為臨床上加味大柴胡湯治療老年人阻塞性黃疸提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

方藥的制備：柴胡10g，黃芩10g，大黃6g，枳實(shí)10g，白芍12g，半夏10g，生姜10g，大棗10g，茵陳30g，金錢草20g（以上飲片均購于武漢市第五醫(yī)院中藥房）。稱取4倍加味大柴胡湯處方量，用水浸泡后加熱煮沸，文火煎煮1h后過濾：按上述方法再煎煮2次，將3次濾液合并后，文火濃縮至含生藥量1g/mL，-20℃冷藏備用（一次性準(zhǔn)備所有加味大柴胡湯用量）。人每日劑量為140g/60kg，大鼠每日劑量為9.3g/kg，分2次灌胃。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)健康SD老年大鼠雌雄共90只，鼠齡為12個(gè)月，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012.體質(zhì)量450-550g，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組、加味大柴胡湯組：后再根據(jù)隨機(jī)原則將每組細(xì)分為3、7、10d 3個(gè)不同時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段10只SD老年大鼠。

1.3主要試劑

丙谷轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（長(zhǎng)春匯力），總膽汁酸（TBA）試劑盒、鈣離子測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天），TEMED、30%丙烯酰胺（Amresco），SDS上樣緩沖液、TG（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蛋白marker（14-120kD）（北京全式金生物技術(shù)有限公司），PVDF膜（0.45txm）（Millipore），兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司），兔多抗TRCP1（55kD，Bioss），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司），ECL底物液（Thermo），包埋石蠟（國藥集團(tuán)），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司），抗熒光淬滅封片劑（Southernbiotech）。

1.4主要儀器

Chemray型全自動(dòng)生化分析儀（美國Ravto公司），Multiskan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Thermoscientific公司），DYY-7C型電泳儀電源、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠），TS-1型水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），T8-1型磁力攪拌器（江蘇省金壇市中大儀器廠），Mulitskan MK3型酶標(biāo)儀（美國Ther-no公司），顯微鏡（奧林巴斯BX53生物顯微鏡）。

1.5模型制備與干預(yù)

造模組術(shù)前24h禁食禁水，腹內(nèi)注射10%水合氯醛溶液麻醉后消毒，上腹正中切口人腹，開腹后膽總管中上1/3行膽總管雙重結(jié)扎，關(guān)腹。假手術(shù)組僅單純游離膽總管后關(guān)腹。術(shù)后6h模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水灌胃（2mL/次，2次/d）;加味大柴胡湯組給予加味大柴胡湯灌胃（2mL/次，2次/d）。分籠飼養(yǎng)，自然光照，溫度20-25℃，濕度20%-30%，自由進(jìn)食水。

1.6標(biāo)本處理

各組大鼠分別于術(shù)后3、7、10d，用10%水合氯醛麻醉后消毒，開胸、開腹，按下列順序取材備檢：（1）從心臟穿刺抽血，放人采血管，離心制備血清后，置于4℃冰箱保存，待測(cè)ALT、AST、TBA、Ca²⁺濃度：（2）游離肝臟，取一塊右肝下葉組織放人EP管中，先置于干冰上，待所有組織取完，移入-80°冰箱保存，用Western-Blot法測(cè)TRPC1蛋白表達(dá)情況：（3）取一塊右肝下葉組織放人裝有多聚甲醛的EP管中，待所有組織取完，常溫保存，用Tunel法檢測(cè)凋亡。

1.7ALT、AST、TBA檢測(cè)

參照試劑盒說明書，采用生化分析法檢測(cè)各組大鼠血清中ALT、AST、TBA含量。

1.8Ca²⁺濃度檢測(cè)

參照試劑盒說明書，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各組老年大鼠肝組織中鈣離子含量。

1.9TRPC1的檢測(cè)

采用免疫蛋白印跡（Western Blot）方法測(cè)定TR-PCI蛋白含量。提取蛋白后將蛋白樣本適當(dāng)稀釋后測(cè)定蛋白濃度，用沸水浴的方法使蛋白變性，然后保存?zhèn)溆谩Ｖ苽銼DS-PAGE電泳膠后，將制備好的蛋白樣品和MAKER加入上樣孔，先恒壓80V電泳至溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120V至溴酚藍(lán)到凝膠底部。電轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉室溫封閉2h，用封閉液稀釋GAPDH和TR-PCI，4℃孵育過夜。用TBST洗去GAPDH和TR-PCI，加稀釋后兔多抗GAPDH和TRPC1.37℃搖床孵育2h，洗去多余GAPDH和TRPC1。顯色曝光后晾干膠片，用Band Scan分析膠片灰度值。樣本蛋白含量以目的條帶和內(nèi)參條帶的積分吸光度比值表示。

1.10肝細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記（Tunel）法測(cè)肝細(xì)胞凋亡。將老鼠肝組織脫水后，用無水乙醇和二甲苯（1：1比例）進(jìn)行透明，透明后的組織在脫水機(jī)中依次經(jīng)3缸石蠟（60℃）進(jìn)行浸蠟。將浸透蠟的組織包埋人石蠟中，組織塊與包埋石蠟融為一體后進(jìn)行切片和烤片。切片脫蠟后用PBS輕輕潤洗切片，每個(gè)樣本上滴加100uL濃度為20ug/mL的Proteinase K溶液，室溫孵育20min。用PBS溶液潤洗樣本后，每個(gè)樣本滴加100uL1xEquilibration Buffer，室溫孵育10-30min。洗掉大部分Buffer后加入TdT孵育緩沖液，將載玻片置于濕盒內(nèi)，在37℃孵育60min，避光。然后用PBS洗滌3次，每次5min。滴加DAPI避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5minx4次洗去多余的DAPI。用吸水紙擦干切片上的液體，封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。熒光顯微鏡下組織切片上調(diào)亡的細(xì)胞呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用“x±s”表示，多組均數(shù)用方差檢驗(yàn)，方差齊后用單因素方差分析，方差不齊用非參多重比較法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1動(dòng)物模型情況

假手術(shù)組老年大鼠精神、飲食等一般情況良好。模型組在術(shù)后眼睛、耳朵及尾部均出現(xiàn)黃染，尿色變黃，精神萎靡，進(jìn)食量下降。加味大柴胡湯組術(shù)后眼睛、耳朵、尾部及尿液均出現(xiàn)變黃的現(xiàn)象，其黃染程度比模型組稍輕，也伴有活動(dòng)減少，飲食量下降的情況。

3.2不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清ALT、AST及TBA含量變化

隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組和加味大柴胡湯組的肝損傷指標(biāo)ALT，AST含量也隨之升高（P<0.01），模型組比大柴胡湯組升高更明顯（P<0.01），且與假手術(shù)組相比，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在各個(gè)時(shí)間段，模型組和大柴胡湯組的TBA水平明顯高于假手術(shù)組（P<0.01），且模型組TBA升高程度比大柴胡湯組更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

3.3不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肝組織中Ca²⁺含量變化

模型組中Ca²⁺含量隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，與假手術(shù)組和和加味大柴胡湯組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

3.4Western檢測(cè)大鼠肝組織中丁RPC1蛋白含量

與假手術(shù)組比較，模型組TRPC1的含量各時(shí)相點(diǎn)出現(xiàn)均高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，加味大柴胡湯組TRPC1的含量各時(shí)相點(diǎn)出現(xiàn)均低于模型組（P<0.01），見表3、圖1。

3.5TUNEL法檢測(cè)各組大鼠肝細(xì)胞凋亡

與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞凋亡率各時(shí)相點(diǎn)均高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，大柴胡湯組細(xì)胞凋亡率各時(shí)相點(diǎn)均低于模型組（P<0.01），見表4.圖2。

4討論

阻塞性黃疸時(shí)膽汁酸排出受阻形成的淤積會(huì)對(duì)肝及其他器官造成一系列損傷，在本次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)老年大鼠進(jìn)行膽總管結(jié)扎后，血清中TBA隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，血清ALT、AST的含量也相應(yīng)升高，而假手術(shù)組沒有發(fā)生明顯的改變。除此之外，光鏡下阻塞性黃疸老年大鼠肝細(xì)胞的凋亡也明顯高于假手術(shù)組，說明隨著膽汁淤積程度的加重，肝組織的損傷也進(jìn)行性加重。與此同時(shí)，肝組織中鈣離子濃度也隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，而假手術(shù)組則無明顯改變，此結(jié)果進(jìn)一步說明，肝組織中鈣濃度的變化與阻塞性黃疸的肝損傷密切相關(guān)。

鈣超載在梗阻性黃疸的肝損傷中起著重要的作用，現(xiàn)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證明肝細(xì)胞及其胞內(nèi)細(xì)胞器Ca²⁺濃度及分布是肝細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能的必要前提，劉慧敏通過實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)持續(xù)的鈣內(nèi)流與SOCE有關(guān)。瞬時(shí)受體電位（transient receptor pot-entieal，TRP）基因編碼了一個(gè)非選擇性陽離子通道的大家族，主要有TRPA，TRPC、TRPV，TRPM、TRPP、TRPN、TRPML7個(gè)亞族。TRPCI是TRPC亞族的一種，位于人染色體3q11.TRPCI基因編碼的TRPCI蛋白主要表達(dá)在胎兒的大腦、肝臟和腎臟，成人的心臟、肌肉、大腦睪丸及卵巢，TRPC1介導(dǎo)SOCE的鈣內(nèi)流。

SOCE通道是Ca²⁺進(jìn)入胞內(nèi)的一種重要途徑，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoDlasmic reticulum，ER）鈣庫耗竭時(shí)被激活。目前研究結(jié)果已表明，部分TRPC通道參與了SOCE通道的組成，另外一部分則由非鈣池依賴的機(jī)制調(diào)控。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)中老年大鼠肝組織中Ca²⁺含量、TRPC1蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比有明顯的升高現(xiàn)象，可以推測(cè)，TRPC1參與了梗阻性黃疸時(shí)SOCE介導(dǎo)的鈣內(nèi)流。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，造模3d后，TRPC1蛋白、Ca²⁺含量與肝細(xì)胞凋亡率均升高，而假手術(shù)組則無顯著變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明了TRPC1與阻塞性黃疸時(shí)鈣超載引起的肝損傷密切相關(guān)。

加味大柴胡湯歷來被運(yùn)用于阻塞性黃疸的治療，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：加味大柴胡湯的治療確實(shí)能降低阻塞性黃疸老年大鼠的肝損傷血清指標(biāo)ALT、AST的濃度，還能降低肝細(xì)胞的凋亡，且在各阻塞時(shí)間段其損傷指標(biāo)與肝細(xì)胞凋亡率均低于用生理鹽水灌胃的模型組：另加味大柴胡湯也能降低引起肝損傷的TBA水平，降低大鼠肝臟中TRPC1蛋白含量的表達(dá)。可見加味大柴胡湯能下調(diào)TRPC1在肝組織中的表達(dá)，減輕肝組織中鈣離子濃度水平，減輕肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝損傷。

基于我國人口結(jié)構(gòu)改變的現(xiàn)狀，老年人的健康問題越來越受到關(guān)注，阻塞性黃疸的老年患者的主要病因?yàn)橄滥[瘤，目前首選治療方案仍為手術(shù)解除梗阻。但老年人由于機(jī)體的儲(chǔ)備及代償能力明顯降低，患阻塞性黃疸時(shí)，肝臟及其他臟器的損傷更為嚴(yán)重，故術(shù)前減輕及防治肝臟的損害顯得尤其重要。本實(shí)驗(yàn)已證明加味大柴胡湯通過下調(diào)TRPC1的表達(dá)減輕鈣超載引起的肝細(xì)胞凋亡而減少肝損傷，對(duì)肝功能的恢復(fù)有一定幫助。但科研工作者還應(yīng)根據(jù)阻塞性黃疸時(shí)線粒體功能障礙，氧自由基生成過多等機(jī)制共同參與了肝損傷的實(shí)際情況，研究加味大柴胡湯是否也可通過上述途徑起作用，或各途徑間是否相互影響，其具體的分子機(jī)制尚須進(jìn)一步探討。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅可證明對(duì)阻塞性黃疸的老年患者，在術(shù)前用加味大柴胡湯進(jìn)行治療可減少肝損傷，降低手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。