帕立骨化醇和依那普利對(duì)ApoE基因缺陷小鼠的脂聯(lián)素表達(dá)和心臟的保護(hù)作用

王洪浩 王慧智 田倩 楊森 方沛鈺 代莉（通訊作者） 歐亞萍

（1 貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科 貴州 貴陽(yáng) 550004）

（2 貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 貴州 貴陽(yáng) 550004）

帕立骨化醇是一種人工合成的具有生物活性的維生素D類似物，同維生素D一樣帕立骨化醇需要通過與維生素D受體（VDR）結(jié)合才能發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)[1]。臨床研究顯示，帕立骨化醇對(duì)心血管疾病、免疫炎癥反應(yīng)、腎臟疾病及腫瘤等都有一定的療效。ACEI抑制劑依那普利屬于腎素血管緊張素（RAS）系統(tǒng)，除了具有調(diào)節(jié)血壓的作用，還能夠改善因RAS活性升高引起的局部組織病理性損傷，Husain等[2]使用ApoE KO小鼠研究有關(guān)帕立骨化醇與依那普利聯(lián)用對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠損傷的藥理作用，發(fā)現(xiàn)兩藥合用能夠顯著逆轉(zhuǎn)小鼠主動(dòng)脈炎性標(biāo)志物COX2、TNF-α、MCP-1等的蛋白表達(dá)，研究結(jié)果說明帕立骨化醇與依那普利的聯(lián)合應(yīng)用不僅能改善ApoE KO小鼠主動(dòng)脈的炎性損傷，還有效抑制了氧化損傷，并且使用療效強(qiáng)于任何一種藥物的單獨(dú)作用。本文旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究維生素D受體激活劑及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑聯(lián)用對(duì)ApoE KO小鼠體內(nèi)及心臟組織脂聯(lián)素表達(dá)、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因素及炎癥因子水平的影響，是否能發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化及心臟保護(hù)作用，探索一種新的治療冠心病的治療靶點(diǎn)，從而為臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 ApoE KO小鼠，體重（25.0±1.8），由貴州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)：SDXK（黔）2015-0003。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25°左右，濕度約50%，保證動(dòng)物自由飲食和進(jìn)水，同時(shí)晝夜循環(huán)光照。40只ApoE KO小鼠隨機(jī)分為四組，使用帕立骨化醇及依那普利進(jìn)行藥物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)治療方式，檢測(cè)維生素D受體激活劑及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑這兩種藥物對(duì)ApoE KO小鼠脂聯(lián)素表達(dá)、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因素及炎癥因子的影響，探索一種新的治療冠心病的治療靶點(diǎn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和方法 全自動(dòng)生化分析儀（日立7170s），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle公司），PCR儀，電泳儀；帕立骨化醇購(gòu)自雅培公司，依那普利購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)。脂聯(lián)素、COX-2、TNF-α試劑盒購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將7周大的ApoE KO小鼠28只隨機(jī)分為四組。給予如下16周的處理：組1：ApoE陰性對(duì)照組（n=6，腹腔內(nèi)注射 100μl 丙二醇 每周3次）；組2：ApoE- 帕立骨化醇組（n=8，200ng 腹腔內(nèi)注射 每周3次）；組3：ApoE-依那普利組(n=8，30mg/kg 腹腔內(nèi)注射 每日一次)；組4：ApoE-帕立骨化醇+依那普利組（n=6帕立骨化醇200ng 腹腔內(nèi)注射 每周3次+依那普利30mg/kg 腹腔內(nèi)注射 每日一次)；通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，按分組飼養(yǎng)要求飼養(yǎng)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分離心臟組織，采集血樣樣本利用生化、免疫組化及病理等方法，觀察各組ApoE小鼠脂聯(lián)素水平、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因素及炎癥因子（如Tch、COX-2、TNF-a等）對(duì)心臟的表達(dá)差異。

1.2.2 標(biāo)本采集 四組ApoE小鼠經(jīng)過16周喂養(yǎng)處理后抽取左心室動(dòng)脈血，并將小鼠血液在8℃條件下4000r/min離心15分鐘，分離上層血清，-20°冰箱保存待測(cè)，采用全自動(dòng)生化分析儀和PCR儀測(cè)定血清Tch、COX2、TNF-α值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行分析，符合正態(tài)性的計(jì)量資料用（±s）表示，兩組以配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，予以χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 各組小鼠死亡情況

至實(shí)驗(yàn)結(jié)束前各組小鼠均未見死亡。

2.2 各組小鼠血清及心臟組織脂聯(lián)素、Tch、COX-2、TNF-α水平表達(dá)對(duì)比

與對(duì)照組相比組2-組4脂聯(lián)素水平均增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），特別是組4脂聯(lián)素水平明顯增高，差異顯著（P＜0.01）；組2-組4Tch水平均明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；組2-組4炎性標(biāo)志物（COX-2、TNF-α）水平減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中組4炎性標(biāo)志物水平明顯降低，差異顯著（P＜0.01）。見表。

表 各組小鼠16周后血清Tch、COX-2、TNF-α水平對(duì)比（±s）

表 各組小鼠16周后血清Tch、COX-2、TNF-α水平對(duì)比（±s）

注：與給藥前比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，#P＜0.01。

組別例數(shù)(n)脂聯(lián)素（ug/ml）Tch（mmol/L）COX-2（mg/L）TNF-α（ug/L）組1612.59±3.465.74±1.335.34±0.658.41±0.24組2814.46±3.25*4.53±2.06*1.75±0.23*3.67±0.08*組3813.83±2.78*3.96±2.45*5.53±0.61*2.39±0.22*組4617.46±4.74*#3.54±1.27*1.28±0.14*#0.16±0.02*#P-0.0000.0000.0000.000

3.討論

帕立骨化醇(paricalcitol)是由雅培公司(Abbott)研發(fā)的一種維生素D類似物，同維生素D一樣需要通過結(jié)合VDR而發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)，帕立骨化醇首先被用于預(yù)防和治療繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(SHPT)。隨著大量研究顯示，帕立骨化醇除了對(duì)SHPT，對(duì)其它如心血管疾病、免疫炎癥反應(yīng)、腎臟疾病及腫瘤等都有一定的療效。體內(nèi)如果缺乏維生素D，就會(huì)增加心血管疾病的發(fā)病率，如高血壓、缺血性心臟病和心力衰竭等，而帕立骨化醇能夠抑制RAS系統(tǒng)活性，起到降壓及有效改善左室重塑的作用。脂聯(lián)素是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有保護(hù)性的脂肪因子，而氧化應(yīng)激是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要機(jī)制之一，因此脂聯(lián)素在保護(hù)心肌、延緩冠心病進(jìn)展等方面發(fā)揮了重要作用。Kyriazi等[3]研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素不僅可以終止 IL-6 和TNF -α介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，還能誘發(fā)巨噬細(xì)胞中抗炎基因的表達(dá)，因此脂聯(lián)素可通過復(fù)雜的抗炎作用來對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化，從而起到保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)帕立骨化醇和依那普利聯(lián)合使用時(shí)，不僅能顯著增加ApoE KO小鼠體內(nèi)脂聯(lián)素的水平，還能有效預(yù)防大動(dòng)脈內(nèi)皮氧化損傷和炎癥的發(fā)生。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)VDRA聯(lián)合ACEI治療能夠顯著增高ApoE KO小鼠血清及心臟組織中脂聯(lián)素水平，顯著降低Tch和COX2、TNF-α水平，這也與既往國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)論相符合。本研究初步闡明了VDAR與依那普利聯(lián)用，不僅能夠改善ApoE KO小鼠動(dòng)脈炎性損傷、抑制氧化損傷，還能保護(hù)心肌抑制左室重塑，從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化及心臟保護(hù)作用，為臨床治療提供了新的理論依據(jù)和治療思路，但本研究樣本量小，還需更多研究及臨床實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。