Orbitrap高分辨質譜用于保健食品中15種 非法添加減肥類藥物的篩查鑒定

譚會潔, 郭常川, 邢 晟, 趙艷霞, 張迅杰, 石 峰, 鞏麗萍

(山東省食品藥品檢驗研究院, 山東 濟南 250101)

隨著我國肥胖人群不斷增加,減肥類藥品及保健食品市場空間越來越大,無數商家競相掘金。與此同時,市場的無序和混亂觸目驚心。一些減肥類保健食品的生產廠家受利益驅動,在保健食品中非法摻入減肥類化學藥,使其符合廣告所宣傳的治療效果以促進銷售,由于處方中沒有標明添加化學藥物的種類及劑量,如使用不當,將對服用者的健康和生命造成危害。為有效打擊這種制假摻偽的不法行為,有必要建立快速、專屬的方法鑒定保健食品中非法摻入的此類藥物。

與減肥功效相關的藥物主要包括食欲抑制劑(如西布曲明、芬氟拉明)、中樞興奮劑(咖啡因、麻黃堿等)、瀉藥(大黃素等)、利尿劑(呋塞米)等[1]。目前已報道的用于檢測非法添加減肥類藥物的分析方法主要包括薄層色譜聯用顯微紅外光譜法[2]、薄層色譜聯用原位拉曼光譜法[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4,5]、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[1,6-13]、液相色譜-高分辨質譜聯用法(LC-HRMS)[14,15]、流動注射-質譜聯用法[16]等。LC-MS由于其具有快速簡便、靈敏度高、選擇性好的優勢,是目前國內外非法添加檢驗領域的最常用方法[17-19]。已報道的LC-MS以低分辨質譜法為主,也有兩篇高分辨質譜法的文獻采用了飛行時間質譜(TOF)[14,15]。作為高分辨質譜兩種不同類型的質量分析器,相對于TOF, Orbitrap由于其質譜掃描分辨率的優勢(最高可達1 000 000 FWHM[20]),能夠大幅提高篩查定性能力,保證結果更加真實可靠,同時具有媲美三重四極桿的定量性能。

本研究根據近年來國內外相關文獻[1-16]及多年的日常非法添加檢驗,確定了西布曲明、酚酞等15種非法添加減肥類化合物作為分析物,旨在開發一種簡便可靠的超高效液相色譜-Orbitrap高分辨質譜聯用(UHPLC-Orbitrap HRMS)方法,同時構建TraceFinder篩查數據庫和自動篩查方法,用于保健食品中15種非法添加減肥類藥物的高精度篩查、鑒定和定量,為日常的減肥類非法添加檢測工作提供更可靠的技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Q ExactivePlusTM超高效液相色譜-質譜聯用系統包括Ultimate 3000液相泵、自動進樣器、柱溫箱以及Orbitrap高分辨質譜(Thermo,德國); XCalibur 4.0軟件(Thermo,美國),用于質譜儀控制和數據處理;Mettler XS205電子天平(梅特勒,瑞士); Sigma 3K15高速冷凍離心機(Sigma,德國); KQ-300 GDV溫控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

15種減肥類對照品均購自中檢院(含量均>98.0%); HPLC級甲醇(純度99.9%)、乙腈(純度99.9%)以及超純水均購自Fisher公司(美國), HPLC級乙酸銨(純度97%)購自ACS恩科化學公司(美國);樣品信息:29批保健食品(全部為膠囊劑)來自山東省食品藥品監督管理局或山東省各市、縣食品藥品監督管理局監督抽樣。隨機挑選未檢出15種減肥類成分的10批樣品,混合均勻,作為陰性樣品基質。10批陰性樣品編號分別為Sample 4、Sample 7、Sample 8、Sample 10、Sample 13、Sample 16、Sample 19、Sample 20、Sample 22和Sample 29。

1.2 實驗條件

1.2.1對照品溶液的制備

分別取麻黃堿、克侖特羅、鹽酸芬氟拉明、鹽酸西布曲明對照品(A組)適量,精密稱定,分別用甲醇溶解并配成500 mg/L的對照品儲備液,各取適量,以甲醇稀釋為100 mg/L的混合對照品溶液I;分別取咖啡因、呋塞米、氯噻酮、苯佐卡因、布美他尼、依他尼酸、酚酞、芐氟噻嗪、大黃素、螺內酯、奧利司他對照品(B組)適量,精密稱定,分別用甲醇溶解并配成500 mg/L的對照品儲備液,各取適量,以甲醇稀釋為100 mg/L的混合對照品溶液II。對照品儲備液、混合對照品溶液I和II均放置于-20 ℃冰箱保存。臨用前,恢復至室溫使用。

分別取混合對照品溶液I和II適量,以50%(v/v)甲醇水溶液逐級稀釋為系列對照品標準溶液(A組化合物質量濃度為1.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L, B組化合物質量濃度為5.0、25、50、100、250、500、1 000 μg/L)。

1.2.2供試品溶液的制備

取供試品適量,研細后稱取約0.5 g,精密稱定,置于50 mL具塞離心管中,加入甲醇20 mL,渦旋1 min混勻,20 ℃恒溫超聲提取15 min,于10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min,上清液過0.22 μm微孔濾膜,取續濾液即得供試品溶液。若測得化合物濃度超過定量上限,則以50%(v/v)甲醇水溶液作為稀釋液,將供試品溶液稀釋后再進行測定。

1.2.3色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 3 μm),流動相:10 mmol/L的乙酸銨溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫程序:0～0.5 min, 5%B; 0.5～20.0 min, 5%B～90%B; 20.0～22.5 min, 90%B; 22.5～22.6 min, 90%B～5%B; 22.6～25.0 min, 5%B。流速:300 μL/min;柱溫:45 ℃;自動進樣器溫度:20 ℃;進樣量:5 μL。

表 1 15種減肥類化合物的Orbitrap HRMS數據庫Table 1 Orbitrap HRMS database of the 15 compounds

1.2.4質譜條件

Q ExactiveTM質譜系統配有HESI源,采用正負離子同時掃描模式,噴霧電壓為3.0 kV(正離子模式)或2.5 kV(負離子模式),毛細管溫度和噴霧溫度分別為350 ℃和250 ℃。鞘氣和輔助氣流速分別設為40和15 arb, S-lens RF電壓為50 V。質譜掃描方式為Full MS/dd-MS2模式。Full MS(一級質譜全掃描)分辨率設為70 000 FWHM,質譜掃描范圍為m/z100～1 000,自動增益控制(AGC)、最大注入時間(IT)分別設為1.0e6和100 ms; dd-MS2(數據依賴的二級質譜掃描)分辨率設為17 500 FWHM, AGC設為2.0e5, IT設為50 ms,分離窗口設為m/z1.0,強度閾值(intensity threshold)設為4.0e4,同位素排除設為“on”,動態排除設為10.0 s。各化合物的步進歸一化碰撞能量(NCE)統一設為20、40、60。表1列出了15種化合物的分子式、保留時間、分子離子準確質量、碎片離子準確質量等信息。

1.3 軟件

使用TraceFinder 3.3軟件(Thermo,美國)進行篩查定性,使用XCalibur 4.0軟件(Thermo,美國)進行定量分析,使用Excel (Microsoft,美國)進行必要的計算。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察

為簡化操作步驟并提取得到盡可能多的化合物,本研究對超聲提取條件進行了優化。分別考察了不同提取溶劑(甲醇、乙腈、50%(v/v)甲醇水溶液、50%(v/v)乙腈水溶液)和不同提取時間(10、15、30 min)的提取效果。結果表明,甲醇作為提取溶劑提取效率最高,而超聲提取15 min和30 min均可達到較高的提取效率。考慮到節省樣品預處理時間,本研究選擇甲醇作為提取溶劑、超聲提取15 min。

分別以50%(v/v)甲醇水溶液稀釋對照品儲備液,得到10 mg/L的15種化合物標準溶液,分別使用單針進樣的方式注入質譜儀,在正、負離子模式下進行全掃描,優化質譜條件(質譜掃描極性、分子離子準確質量、噴霧電壓、毛細管溫度和噴霧溫度、鞘氣和輔助氣流速等),輸入至方法設置中。在建立的LC-MS聯用方法中,質譜掃描方式選擇正負離子切換Full MS/dd-MS2模式,此模式包含一級全掃描和數據依賴的二級掃描,得到高精度一級質譜和二級質譜。其中,高分辨一級質譜圖用于化合物的篩查、鑒定和定量,二級質譜圖用于化合物確認。

為選擇最佳流動相,本研究考察對比了甲醇-水和乙腈-水混合體系,并在水相中分別添加了0.1%(v/v)甲酸水溶液、10 mmol/L甲酸銨、10 mmol/L乙酸銨等。結果表明,乙腈-10 mmol/L乙酸銨流動相體系可獲得最佳的色譜峰形和分離效果,且正離子和負離子模式的不同化合物均能獲得較高的質譜響應。因此,本研究選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相體系,并采用梯度洗脫程序。

圖 1 15種減肥類化合物的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 15 weight loss compounds

2.2 方法學考察

2.2.1專屬性

取陰性樣品,按1.2.2節方法處理得到空白基質溶液,進樣分析。空白基質溶液的提取離子色譜圖(extracted ion chromatograms, XICs)中,各化合物保留時間處沒有干擾峰出現或干擾峰很小(低于定量限的10%),方法專屬性強。

取對照品標準溶液(A組化合物濃度為5.0 μg/L, B組化合物濃度為25 μg/L)進樣分析,記錄色譜圖(見圖1)。15種減肥類化合物可在25 min內完成色譜分離和洗脫,峰形好,靈敏度高。代表性化合物----芬氟拉明的二級質譜圖及裂解機理如圖2和圖3所示,二級質譜碎片離子有助于確證化合物的存在,裂解機理闡明了主要碎片離子可能的化學結構及裂解途徑。

2.2.2基質效應

分別制備空白基質加標溶液和對照品標準溶液(A組化合物濃度約為20 μg/L, B組化合物濃度約為100 μg/L),分別進樣,計算二者響應值百分比,即為基質效應[21]。15種化合物的基質效應在87.9%～105.4%范圍內,證明空白基質對化合物響應影響很小。

2.2.3線性范圍和靈敏度

取系列標準溶液進樣測定。以峰面積作為y,標準溶液質量濃度作為x,擬合校正曲線,建立回歸方程,計算相關系數(r)。15種化合物的峰面積與質量濃度的線性關系良好,r均大于0.998,線性范圍寬,可滿足準確定量的需求。以標準曲線最低點作為定量限(S/N≥10)。結果見表2。

圖 2 芬氟拉明的二級質譜圖及碎片離子結構推斷Fig. 2 MS2 spectrum of fenfluramine with fragment ion structures tentatively assigned

圖 3 芬氟拉明的二級碎片裂解機理Fig. 3 Fragmentation mechanism of fenfluramine

2.2.4回收率和精密度

精密稱取陰性供試品0.50 g至50 mL具塞離心管中,分別加入20 mg/L的A組混合對照品溶液20 μL、20 mg/L的B組混合對照品溶液100 μL,再加入20 mL甲醇,按照1.2.2節所述方法處理得到供試品溶液,其中A組化合物質量濃度約為20 μg/L, B組化合物濃度約為100 μg/L。平行測定6次,計算回收率平均值和精密度(RSD),數據見表3。得到15種減肥類化合物的回收率范圍為79.7%～95.4%,精密度在3.3%～8.7%之間。

2.2.5穩定性

考察了100 μg/L標準溶液在自動進樣器中放置1、2、4、8、12、24、48 h的穩定性,15種化合物在上述時間下的穩定性為 97.8%±2.5%(平均值±RSD),說明該條件下樣品穩定性良好。

2.3 篩查數據庫的開發與應用

本研究通過TraceFinder 3.3軟件實現了快速自動篩查。首先,建立篩查數據庫和篩查方法。通過對照品溶液的UHPLC-HRMS進樣分析可獲得15種減肥的保留時間、一級質譜和二級質譜準確質量,據此建立15種減肥類化合物的篩查數據庫,如表1所示。在數據庫中保存化合物的特征信息,如化合物名稱、分子式、可能的加合物(如[M+H]+、[M-H]-等)、保留時間、分子離子準確質量、碎片離子準確質量等。然后設定篩查的各項參數,建立篩查方法。以分子離子和保留時間作為鑒定依據,碎片離子和同位素分布作為確證依據。峰面積閾值設為10 000 000,分子離子準確質量和碎片離子準確質量偏差閾值均設為5×10-6(5 ppm),保留時間窗口設定為15 s,用于確證的碎片離子數量至少為2,同位素分布的擬合閾值設為90%,質量偏差閾值設為5×10-6(5 ppm),同位素離子強度偏差閾值設為10%。

將UHPLC-HRMS采集的所有樣品原始數據(raw格式)直接導入TraceFinder軟件,以建立的篩查數據庫和篩查方法進行自動篩查。軟件會把儀器采集的樣品信息與篩查數據庫、篩查方法和接受標準進行自動比對。如果樣品中某個離子的4個篩查選項(即分子離子準確質量、保留時間、碎片離子準確質量及同位素分布)均符合篩查標準(通過標準則綠燈亮起),則判定樣品為陽性。圖4～6給出了代表性樣品Sample 3的提取離子色譜圖、一級全掃描質譜圖、同位素分布比對圖及二級質譜比對圖,圖中顯示了Sample 3的[M+H]+232.130 8離子實測和理論保留時間偏差(0.03 min,即1.8 s)、分子離子準確質量與理論值偏差(-1.256 1×10-6(-1.256 1 ppm))、碎片離子準確質量與理論值偏差(均小于2×10-6(2 ppm))及同位素分布(評分為100%)均在篩查方法設定的接受標準之內。4個篩查選項標記均為綠燈,Flag標記也為綠燈,表明軟件判定Sample 3檢出了芬氟拉明。因此,使用已建立的數據庫和篩查方法進行高度可靠的快速自動篩查,可以將假陽性和假陰性樣品的風險降至最低。

表 2 15種化合物的回歸方程、相關系數和線性范圍Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r), and linear ranges of the 15 compounds

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 3 減肥類化合物的回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the 15 compounds (n=6)

圖 4 代表性陽性樣品的提取離子色譜圖及一級全掃描質譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms (XICs) and full scan mass spectrum of a representative positive sample

圖 5 代表性陽性樣品中芬氟拉明的同位素分布及TraceFinder比對Fig. 5 Isotope pattern and the TraceFinder fit of a representative positive sample

圖 6 代表性陽性樣品中芬氟拉明的二級質譜圖及TraceFinder比對Fig. 6 MS2 spectra and the TraceFinder fit of a representative positive sample

2.4 實際樣品檢測

將建立的UHPLC-Orbitrap HRMS分析方法用于29批保健食品樣品中非法添加減肥類藥物的檢測,將得到的raw原始數據文件導入TraceFinder 3.3篩查軟件,根據TraceFinder中建好的篩查數據庫和篩查方法進行快速自動篩查,并使用XCalibur軟件對陽性樣品進行定量分析。

在總計29批次樣品中檢出6批陽性樣品,陽性率為20.7%。檢測到的非法添加物涉及鹽酸西布曲明、酚酞、鹽酸芬氟拉明、依他尼酸,非法添加物含量(見表4)差異很大,有的甚至遠超臨床用量。此外,在陽性樣品中還發現了幾種化合物同時添加的現象,如Sample 14同時添加了鹽酸芬氟拉明與依他尼酸。這些結果表明了非法添加的隨意性及不可預料性,對消費者健康具有較大危害。

表 4 陽性樣品檢出成分及含量Table 4 Detected compounds and their contents in positive samples

3 結論

本研究建立了檢測保健食品中非法添加減肥類藥物的液相色譜-高分辨質譜聯用法,采用TraceFinder軟件構建了Orbitrap高分辨質譜數據庫,建立了篩查方法,將液相色譜-質譜聯用儀采集的數據導入TraceFinder軟件進行快速、自動篩查分析。陽性樣品可使用XCalibur軟件進行定量。本方法靈敏度高、選擇性好,篩查分析結果準確可靠,自動化程度高,可滿足同時定性和定量的需求,適用于保健食品中減肥類藥物的非法添加檢測,已用于日常檢測工作中,為監管減肥類非法添加提供了有力的技術支持。